棗樹皮提取物的抑菌作用

王英超++周智瑞++金紅++冉早紅

摘 要：利用超聲提取法和牛津杯抑菌法研究棗樹皮的抑菌效果。以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛德華菌為試驗菌，對提取方法、抑菌方法、提取溶劑等條件分別進行抑菌試驗研究。結果表明：以70%乙醇為提取溶劑，超聲波提取法得到的提取液抑菌效果最好；牛津杯法的抑菌效果強于濾紙片法；金絲小棗的老樹皮的抑菌效果強于新樹皮。不同品種棗樹皮的抑菌效果大小為：金絲小棗老樹皮>紅棗老樹皮>馬牙棗老樹皮。金絲小棗老樹皮在大腸桿菌與溫和氣單胞菌中的最低抑菌濃度為7.5×10-4 g·mL-1，在枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌與遲緩愛德華菌中的最低抑菌濃度都為3.8×10-4 g·mL-1。棗樹皮提取物對5種菌有較強的抑菌效果。

關鍵詞：棗樹皮；超聲波提取；抑菌效果

中圖分類號：S665.1 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.12.009

Antibacterial Effect of Jujube Bark Extraction

WANG Yingchao1，ZHOU Zhirui 1，JIN Hong2，RAN Zaohong2

（1.College of Basic Science，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China；2. College of Agronomy and Resource Environment，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China）

Abstract：The way of study on bacteriostatic effect of jujube bark extract was ultrasonic extraction and Oxford cup bacteriostaswas. The E. coli， Bacillus subtilwas， Aeromonas hydrophila， Aeromonas sobria and Edwardsiella tarda were selected as the experimental bacteria. The extraction methods， antimicrobial methods， extraction solvents and other conditions were studied respectively. The results showed that the concentration of 70% ethanol as extraction agent， the extract obtained by ultrasonic extraction method had the best bacteriostastic effect. By Oxford cup method， the bacteriostatic effect was better than that of filter method. Gold thread jujube old bark bacteriostaswas effect was stronger than the new bark. Gold thread jujube old bark bacteriostaswas effect in different jujube bark bacteriostaswas effect was the strongest， followed by red dates tree bark， the weakest was Maya jujube tree bark. Gold thread jujube old bark for the minimal inhibitory concentrations （MIC） of E. coli and Aeromonas sobria was 7.5 × 10-4 g·mL-1， for Bacillus subtilwas， Aeromonas hydrophila and Edwardsiella tarda minimal inhibitory concentrations （MIC） was 3.8 × 10-4 g·mL-1. Jujube peel extract had strong inhibitory effect on 5 kinds of bacteria.

Key words： jujube tree bark； ultrasonic extraction； antibacterian effect

棗樹皮作為一味中藥歷史悠久。在《本草綱目》的記載中，棗樹皮可以外敷用來治療由于燒灼而造成的燒傷與外傷出血，內服可以收斂止瀉、鎮咳[1-2]。目前對棗樹的研究主要集中于棗的果肉部分及樹皮中的真菌[3-10]，鮮見利用棗樹皮提取物進行抑菌效果研究。本試驗以70%濃度的乙醇為提取溶劑，通過超聲波法提取棗樹皮有效成分，用牛津杯法進行抑菌試驗探究其抑菌效果，以期為棗樹皮的開發利用提供參考，也為新的植物源抑菌劑的研究開發提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

棗樹皮：金絲小棗樹皮取自河北滄州棗園。馬牙棗、紅棗樹皮取自靜海縣子牙鎮棗園。用清水洗凈樹皮后，60 ℃烘干，粉碎過孔徑0.21 mm的篩備用。

菌種：天津農學院生化實驗室保存，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛德華菌。

1.2 試 劑

乙酸乙酯、濃鹽酸、氫氧化鈉（粒狀）、氯化鈉購自天津市風船化學試劑科技有限公司；牛肉蛋白胨購自天津艾勒科技有限公司；酵母浸粉購自北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉購自上海藍季科技發展有限公司；無水乙醇購自天津市華東試劑廠。

1.3 儀 器

DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海恒科技有限公司；YS-08型粉碎機，北京燕山正德機械設備有限公司；BSA223S型電子天平，賽多利斯（北京）科學儀器有限公司；P180H型超聲波清洗器，Elma-Hans Schmidbauer GmbH； L550型臺式低速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.4 方 法

1.4.1 菌種的活化及菌懸液的制備 將保存的5個菌種活化于固體斜面培養基上。大腸桿菌與枯草芽孢桿菌放在37 ℃培養箱中培養，嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌與遲緩愛德華菌放在28 ℃培養箱中培養。24～48 h后活化完成。將活化好的菌種，用無菌水稀釋至菌懸液的濃度為105～106 CFU·mL-1備用。

1.4.2 棗樹皮提取物的制備 將棗樹皮按料液比1∶15（g·mL-1）加入70%的乙醇進行超聲提取。超聲功率266 W、60 ℃下提取60 min。提取結束后，4 000 r·min-1離心10 min，將上清液過濾后減壓旋蒸，收集提取物粉末備用。

1.4.3 不同提取方法對抑菌效果的影響 （1）浸提法：取金絲小棗樹皮粉末，按1∶15料液比（g·mL-1）加入70%乙醇，60 ℃下浸提48 h。（2）水浴回流法：取金絲小棗樹皮粉末，按1∶15料液比（g·mL-1）加入70%乙醇，60 ℃下水浴回流6 h。（3）超聲波提取法：取金絲小棗樹皮粉末，按1∶15料液比（g·mL-1）加入70%乙醇。超聲功率266 W，60 ℃下超聲提取60 min。取上述3種方法得到的上清液分別過0.22 μm的有機濾膜過濾除菌，以牛津杯法做抑菌實驗，比較不同提取方法下的抑菌效果。

1.4.4 不同抑菌方法的比較 （1）牛津杯法（牛津杯的內徑為7.5 mm）。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛德華菌用1.4.1的方法制備成菌懸液。用移液槍吸取100 μL菌懸液于LB培養基上，涂布均勻放上牛津杯，靜置1 h。待牛津杯底部與培養基表面緊密貼合后，再用移液槍吸取棗樹皮提取液于牛津杯中。放入恒溫培養箱中培養，觀察抑菌效果。

（2）濾紙片法。將濾紙片用7.5 mm內徑的打孔器制成小圓片，經過濕熱滅菌后放入棗樹皮提取液中浸泡48 h后備用。將5種菌涂布在培養基上，將蘸有提取物的濾紙圓片放在培養基表面。放入恒溫培養箱中培養，觀察抑菌效果。用牛津杯法與濾紙片法分別做3次平行試驗，根據抑菌圈大小比較兩種方法的抑菌效果。

1.4.5 不同提取溶劑對抑菌效果的影響 選取水、70%乙醇和乙酸乙酯為提取溶劑進行比較。稱取3份金絲小棗樹皮粉末，每份10 g，分別以水、70%乙醇和乙酸乙酯為提取溶劑。按照1.4.2條件進行超聲提取。用牛津杯法進行抑菌試驗，根據抑菌圈大小比較各提取溶劑的提取效果。

1.4.6 新樹皮與老樹皮抑菌效果的影響 選取金絲小棗的新樹皮與老樹皮粉末通過1.4.2的方法制備提取液。牛津杯法進行抑菌試驗，比較二者抑菌圈的大小，分析它們的抑菌效果的強弱。

1.4.7 不同品種棗樹皮的抑菌效果的比較 取金絲小棗，馬牙棗和紅棗3種老樹皮粉末通過1.4.2的方法制備提取液。牛津杯法進行抑菌試驗，測量出3種棗樹皮的抑菌圈的的大小。根據抑菌圈大小比較抑菌效果的差異。

1.4.8 最小抑菌濃度的確定 選用金絲小棗老樹皮旋蒸后提取物，采用2倍稀釋法對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、和遲緩愛德華菌進行對應的抑菌試驗，分析其最小抑菌濃度。

2 結果與分析

2.1 提取方法對抑菌效果的影響

不同提取方法的抑菌效果見表1。由表1可知， 浸提法提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、溫和氣單孢菌無抑菌效果，對嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華菌具有一定的抑菌效果，抑菌圈平均有效直徑達到1.5 mm。水浴法提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、溫和氣單孢菌無抑菌效果，對嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華菌具有一定的抑菌效果，抑菌圈平均有效直徑分別達到2，3 mm。超聲法提取物對5種菌均具有抑菌效果，抑菌圈平均有效直徑范圍在0.5～3.5 mm。綜合以上3種提取方法的抑菌效果，選定超聲法作為后續試驗提取方法。

2.2 抑菌方法的比較

牛津杯法與濾紙片法比較結果見表2。由表2可知，濾紙片法得到的抑菌圈直徑大小為7.5 mm，本身的直徑大小也是7.5 mm，表明濾紙片法對以上5種菌沒有抑菌效果。這可能是由于濾紙片貼在培養皿的表面后，由于浸染的提取液主要成分是70%乙醇，乙醇的揮發導致提取液有效成分結晶析出而不能產生抑菌作用。牛津杯法測得棗樹樹皮提取物在5種菌中的抑菌圈直徑分別為8.5，10.6，10.0，8.8，11.2 mm，減去牛津杯外徑7.5 mm，即平均有效抑菌直徑分別為1.0，3.1，2.0，1.3，3.7 mm。故而選用牛津杯法進行后續的抑菌試驗。

2.3 提取溶劑對抑菌效果的影響

由表3可知，水與乙酸乙酯作為提取劑提取的物質對5種菌均無抑菌效果。以70%的乙醇作為提取劑時，提取物對大腸桿菌、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌具有較弱的抑菌效果，對遲緩愛德華菌和枯草芽孢桿菌有較強的抑菌效果。所以，選用70%的乙醇作為棗樹皮的提取溶劑。

2.4 新樹皮與老樹皮對抑菌效果的影響

由表4可知，金絲小棗老樹皮對于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛德華菌的抑菌圈直徑都大于金絲小棗新樹皮的平均有效抑菌圈直徑。金絲小棗新樹皮對于遲緩愛德華菌的抑菌效果最強，平均有效抑菌直徑為3.0 mm；其次為溫和氣單胞菌，平均有效抑菌直徑為1.0 mm。老樹皮對嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華菌的抑菌效果強于其它3種菌。這可能是由于老樹皮的生長時間相對于新樹皮更長，積累的抑菌有效成分會更多。

2.5 不同品種棗樹皮抑菌效果的比較

由表5可知，在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛德華菌5種菌的抑菌效果比較中，馬牙棗老樹皮對5種菌的抑菌效果最差，平均有效抑菌圈直徑分別為0，1.0，2.0，2.5，0 mm。金絲小棗老樹皮在枯草芽孢桿菌、溫和氣單胞細菌、遲緩愛德華菌中的抑菌效果較好，平均有效抑菌直徑均為3.5 mm。對大腸桿菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果較差。紅棗老樹皮在大腸桿菌和溫和氣單胞細菌中的抑菌效果最好，平均有效抑菌直徑為3.5 mm，對其它3種菌的抑菌效果較弱。綜合分析抑菌效果，金絲小棗老樹皮抑菌效果稍強于紅棗樹皮，馬牙棗老樹皮抑菌效果最弱。究其原因可能是因為不同種類棗樹皮的抑菌成分及其含量有所不同造成。

2.6 棗樹皮提取物在5種細菌中最低抑菌濃度的測定

由表6可知，大腸桿菌與溫和氣單胞菌在稀釋2倍后無抑菌效果，故而其最低抑菌濃度為7.5×10-4 g·mL-1。枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌與遲緩愛德華菌在稀釋4倍后無抑菌效果，所以其最低抑菌濃度為3.8×10-4 g·mL-1。

3 討 論

在傳統的棗樹皮的使用中，多為煎煮內服治療止瀉、研磨成粉外敷愈合燒傷。棗樹皮內含有黃酮、單寧等多種有效成分，同時也可能含有萜類、生物堿類、苷類、木脂素、酯類、酚類、醛類、醇類、甾類等抑菌成分，可以利用現代技術工藝加工棗樹皮，利用其更大的藥用價值。試驗表明，棗樹皮提取物對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和遲緩愛德華菌這3種水產治病菌都有一定的抑菌效果。所以，在實際的水產養殖中，可以將棗樹皮抑菌劑與化學藥劑交替使用，防治魚類疾病，其植物源類抑菌劑綠色安全的特點可以緩解水產品食用安全問題。

4 結 論

采用超聲法進行提取棗樹皮的有效成分，牛津杯法進行抑菌試驗。結果發現，以70%的乙醇作為提取溶劑抑菌效果最好；金絲小棗樹皮的老樹皮的抑菌效果強于新樹皮，且對于大腸桿菌與溫和氣單胞菌的最低抑菌濃度為7.5×10-4 g·mL-1，對于枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌與愛德華遲緩菌最低抑菌濃度為3.8×10-4 g·mL-1。在不同種類的棗樹樹皮抑菌效果中，金絲小棗樹皮抑菌效果最好，紅棗樹皮次之，馬牙棗樹皮最弱。

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