廣葉繡球菌多糖脫蛋白方法比較研究*

王宏雨，林 勇，林衍銓，廖劍華，曾 輝，張 迪（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014）

廣葉繡球菌多糖脫蛋白方法比較研究*

王宏雨，林 勇，林衍銓，廖劍華，曾 輝，張 迪**
（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014）

采用水提醇沉法從廣葉繡球菌子實(shí)體中提取繡球菌多糖，以多糖保留率、脫蛋白率和DPPH自由基清除率為指標(biāo)，比較Sevag法、三氯乙酸法和樹(shù)脂吸附法3種方法對(duì)廣葉繡球菌多糖脫蛋白效果的影響和對(duì)純化多糖的抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，綜合3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的結(jié)果，樹(shù)脂吸附法蛋白具有較高的蛋白脫除率、較高的多糖保留率和較好的DPPH自由基清除率，效果最好，3種脫蛋白方法中廣葉繡球菌多糖的最佳脫蛋白方法為樹(shù)脂吸附法。

廣葉繡球菌；脫蛋白；多糖；抗氧化活性

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia） 子實(shí)體潔白細(xì)嫩，鮮美可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，特別是子實(shí)體中含有的β-葡聚糖具有提高人體免疫力、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)傷口愈合、抗菌、抗炎、抗氧化等功效，在保健品、藥品方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景[1-5]。

廣葉繡球菌多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等生物學(xué)活性，有很好的研究與開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。提取的粗多糖通常含有較多蛋白質(zhì)，與糖形成復(fù)合物，影響多糖性質(zhì)和生物活性。因此，探尋1種脫蛋白效果較好，多糖損失率較低，對(duì)多糖生物活性破壞較小的脫蛋白方法尤為重要。

1 材料與方法

1.1 供試材料

廣葉繡球菌子實(shí)體為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所林衍銓研究團(tuán)隊(duì)提供。冷凍真空干燥，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

試劑：DPPH購(gòu)自日本W(wǎng)OKO公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：Centrifuge 5804 R冷凍離心機(jī)；日立U1900紫外掃描分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；L535-1臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；真空冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；BS系列電子天平，北京賽多利斯系統(tǒng)儀器有限公司；超純水器Milli-Q plus，Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 廣葉繡球菌多糖提取

稱取廣葉繡球菌子實(shí)體干品粉末，按照料液比1∶5，80℃浸提3 h，濾渣加水再按相同步驟提取1次，合并2次濾液，離心，上清液減壓濃縮后加入3倍體積95%的乙醇醇沉，8 000 r·min-1離心20 min取沉淀。沉淀真空干燥去除殘余乙醇，即得到繡球菌粗多糖。

1．3．2 脫蛋白方法

Sevag法參照文獻(xiàn) [6]；三氯乙酸法參照文獻(xiàn)[7]；樹(shù)脂吸附法：所用樹(shù)脂為大孔吸附樹(shù)脂HZ-830，具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn) [8-12]。

1．3．3 多糖含量和蛋白質(zhì)含量測(cè)定

多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法，蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[13]。

1．3．4 DPPH自由基清除率測(cè)定

DPPH自由基清除率測(cè)定參照文獻(xiàn) [14]。

1．3．5 多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率計(jì)算

多糖保留率（P1）公式為：

式中：m1表示脫色后多糖含量；m2表示脫色前多糖含量。

蛋白質(zhì)脫除率（P2）公式為：

式中：m3表示脫色前蛋白質(zhì)濃度；m4表示脫色后蛋白質(zhì)濃度。

所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17．0統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 3種脫蛋白方法脫蛋白率比較

3種脫蛋白方法蛋白質(zhì)脫除率比較情況見(jiàn)圖1。

圖1 3種脫蛋白方法蛋白質(zhì)脫除率比較Fig．1 Protein removal ratio of three deproteinazation technologies

由圖1可以看出，廣葉繡球菌多糖經(jīng)過(guò)3種方法脫蛋白后，樹(shù)脂吸附法的蛋白脫除率最高，可以達(dá)到86．87%。其次是TCA法，脫除率達(dá)到73．73%，蛋白脫除率最低的是Sevag法，脫除率為43．08%。

2.2 3種脫蛋白方法多糖保留率比較

3種脫蛋白方法多糖保留率比較情況見(jiàn)圖2。

圖2 3種脫蛋白方法多糖保留率比較Fig．2 Polysaccharide retention of three deproteinazation technologies

從圖2可以看出，廣葉繡球菌多糖經(jīng)過(guò)3種方法脫蛋白后，樹(shù)脂吸附法和TCA法多糖保留率較高，分別為80．49%和79．97%。Sevag法多糖保留率較低，保留率為72．60%。Sevag法是比較傳統(tǒng)的脫蛋白方法，較為溫和，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)破壞不大，但去除蛋白質(zhì)同時(shí)也會(huì)除去少量粘附的多糖，次數(shù)越多，損失也會(huì)越多，因此Sevag法的多糖損失率較高，保留率較低。

2.3 3種脫蛋白方法對(duì)抗氧化活性影響

3種脫蛋白方法抗氧化活性比較情況見(jiàn)圖3。

圖3 3種脫蛋白方法DPPH·清除率比較Fig．3 DPPH·scavenging capacity of three deproteinazation technologies

從圖3可以看出，廣葉繡球菌多糖經(jīng)過(guò)3種方法脫蛋白后，TCA法脫蛋白的繡球菌多糖抗氧化活性最強(qiáng)，DPPH·清除率為58．78%；其次是樹(shù)脂吸附法，DPPH·清除率為53．25%；最低的是Sevag法，DPPH·清除率為41．25%。TCA法和樹(shù)脂吸附法能夠在脫蛋白的同時(shí)保證繡球菌多糖的活性。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)脫除率、多糖保留率和DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較了Sevag法、三氯乙酸法、樹(shù)脂吸附法3種脫蛋白方法對(duì)廣葉繡球菌脫蛋白效果的影響。綜合3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的結(jié)果，樹(shù)脂吸附法具有較高的蛋白脫除率、較高的多糖保留率和較好的DPPH自由基清除率，效果最好。

三氯乙酸法脫蛋白是利用三氯乙酸與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性鹽形成沉淀，適用于除去蛋白含量較高的多糖，但其酸性較強(qiáng)，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)破壞較大；Sevag法是比較傳統(tǒng)的脫蛋白方法，較為溫和，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)破壞不大，但去除蛋白質(zhì)同時(shí)也會(huì)除去少量粘附的多糖，因此Sevag法脫蛋白后多糖損失較多，次數(shù)越多，損失也會(huì)越多，因此Sevag法的多糖損失率較高，保留率較低。利用樹(shù)脂吸附法脫除繡球菌多糖中的蛋白，蛋白質(zhì)脫除率最高，多糖損失率最低，抗氧化活性較好。并且樹(shù)脂吸附法脫蛋白過(guò)程沒(méi)有用到有機(jī)溶劑，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)破壞小，不需要后期進(jìn)行有機(jī)溶劑的去除與回收。此外樹(shù)脂吸附法脫蛋白的同時(shí)可實(shí)現(xiàn)對(duì)多糖的脫色，樹(shù)脂吸附工藝參數(shù)便于工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。

[1]Kimura T．Natural products and biological activity of the pharmacologically active cauliflowermushroom Sparassis crispa[J]．BioMed Research Intermational,2013,8（3）:501-508．

[2]董彩虹，馬琪琪．珍稀食用菌繡球菌的研究進(jìn)展[J]．菌物研究，2014，12（3）：172-177．

[3]Chandrasekaran G,Oh DS,Shin HJ．Properties and potential applications of the culinary-medicinal cauliflower mushroom, Sparassis crispa Wulf．:Fr．（Aphyllophoromycetideae）：a review[J]．International Journal of Medicinal Mushrooms,2011, 13（2）:177-183．

[4]Kim HS,Kim JY,Ryu HS,et al．Induction of dendritic cell maturation by β-glucan isolated from Sparassis crispa[J]．International Immunopharmacology,2010,10（10）:1284-1294．

[5]Kim HH,Lee S,Singh TS,et al．Sparassis crispa suppresses mast cell-mediated allergic inflammation:role of calcium, mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-κB[J]．Intermational Journal of Molecular Medicine,2012,30（2）: 344-350．

[6]謝麗源，彭衛(wèi)紅，甘炳成．桑黃多糖脫蛋白方法與條件的優(yōu)化[J]．農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)：英文版，2011，12（9）：1249-1251．

[7]朱美靜，童群義．猴頭多糖脫蛋白方法的研究[J]．河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，26（4）：25-27．

[8]李會(huì)霞．茶樹(shù)菇多糖提取工藝與生物活性關(guān)系的研究[D]．福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2010．

[9]王宏雨，張迪，廖劍華，等．響應(yīng)面法優(yōu)化繡球菌多糖脫色工藝研究[J]．福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，29（1）：67-71．

[10]秦俊哲，張慧洋．大孔吸附樹(shù)脂去除桑黃粗多糖中蛋白的研究[J]．食品工業(yè)科技，2010，31（12）：263-265．

[11]肖杰，姚凌云，孫健，等．樹(shù)脂法同時(shí)脫除蟲(chóng)草粗多糖中色素與蛋白質(zhì)[J]．食品工業(yè)科技，2012，33（7）：236-239．

[12]方婷，曾紅亮，陳曉垚，等．豬肚菇粗多糖脫蛋白脫色工藝優(yōu)化研究[J]．熱帶作物學(xué)報(bào)，2015，36（6）：1166-1172．

[13]唐志紅，王藝，馬紅婷，等．滸苔多糖脫蛋白工藝的考察[J]．食品研究與開(kāi)發(fā)，2015（11）：90-93．

[14]王宏雨，毛方華，陳體強(qiáng)，等．竹蓀抗氧化物質(zhì)超聲波循環(huán)提取工藝[J]．福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，27（7）：743-746．

Comparative Study on Deproteinization Technology of Sparassis latifolia Polysaccharide

WANG Hong-yu,LIN Yong,LIN Yan-quan,LIAO Jian-hua,ZENG Hui,ZHANG Di
（Institute of Edible&Medicinal Fungi,Fujian Academy of Agicultural Sciences,Fuzhou 350014,China）

To investigate the deproteinazation technology of Sparassis latifolia polysaccharides,the effect of different methods such as sevag method,trichloracetic acid method and resin method was evaluated in terms of the ratio of protein removal, polysaccharide retention and scavenging DPPH free radical．This study provided the resin method was better than the other two methods,with the hightest protein removal,higher polysaccharide retention and better DPPH free radical scavenging capacity．

Sparassis latifolia;deproteinization;polysaccharide;anti-oxidant activity

S646.9

A

1003-8310（2017）01-0063-03

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．01．015

福建省屬公益類科研院所專項(xiàng)（2014R1020-5）；福建省屬公益類科研院所專項(xiàng)（2014R1020-2）；福建省屬公益類科研院所專項(xiàng)（2015R1020-7）。

王宏雨（1984-），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌提取加工技術(shù)研究。E-mail:wanghongyu0928＠126．com

**通信作者：張迪（1983-），男，碩士，助理研究員，主要從事食用菌天然產(chǎn)物研究。E-mail:photohost＠126．com

2016-11-22