蟲草核苷類成分的提取方法

李建平，曾文波（文山學院環境與資源學院，云南 文山 663099）

蟲草核苷類成分的提取方法

李建平，曾文波*
（文山學院環境與資源學院，云南 文山 663099）

該研究篩選出1種提取蟲草核苷類成分的方法。采用高效液相色譜法，流動相為10%甲醇溶液，流速為1 mL·min-1，檢測波長260 nm，進樣量10 μL，測定不同提取溶劑和提取條件制備供試液中尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素含量。結果表明，當提取溶劑為20%甲醇溶液，提取方法為超聲處理，提取時間為90 min，提取次數為3次，蟲草樣品中核苷類成分可被充分提取。該方法適用于蟲草水溶性核苷類成分供試液的制備，為準確測定蟲草類真菌樣品水溶性核苷類成分提供了依據。

蟲草類真菌；核苷類成分；HPLC；提取

蟲草類真菌（Cordyceps-like fungi）是一類寄生于昆蟲、蜘蛛等節肢動物和一些真菌上的真菌類群[1，2]。按照真菌詞典第10版、Sung等和Kepler等關于蟲草類真菌的分類系統[1-3]，分別屬于真菌界（Fungi）子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomyceles）肉 座 菌 亞綱 （Hypocreomycetidae） 肉 座 菌 目（Hypocreales） 中的3個科5個屬，包括艷蟲草科（Cordycipitaceae） 蟲草屬（Cordyceps），線蟲草科（Ophiocordycipitaceae） 大團囊蟲草屬（Elaphocordyceps）、線蟲草屬 （Ophiocordyceps）、多頭霉屬（Polycephalomyces）和麥角菌科（Clavicipitaceae）泛蟲草屬（Metacordyceps）。目前，市場上最常見的蟲草主要有蟬花蟲草（Isaria cicadae Miq．）、冬蟲夏草[Ophiocordyceps sinensis（Berk．）G．H．Sung,J．M．Sung, Hywel-Jones&Spatafora]和蛹蟲草 [Cordyceps militaris（Fr．）Link．]等。蟲草具有調節人體免疫系統、抗腫瘤、調節腎功能、恢復肝功能、抗氧化和調節心血管功能等多種藥理藥效[4-7]，主要含糖醇類、氨基酸類、核苷類、甾醇類、生物堿類和無機元素等化學成分[7]。其中，水溶性核苷類成分是蟲草類真菌中主要活性成分之一[8]。HPLC是測定水溶性核苷類成分的主要方法之一[9-14]。該方法樣品前處理溶劑主要有水、甲醇和甲醇溶液，提取方法有超聲法和熱水浴法，提取時間為15 min至120 min[9，11，12，15-20]。同一種蟲草中核苷類成分含量差異較大，這除了與蟲草不同的地理來源和蟲草成熟度相關以外，還與蟲草樣品前處理方法有關[12]。

本研究以蟬花蟲草、冬蟲夏草和蛹蟲草等為試驗材料，采用HPLC測定蟲草樣品中尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素的含量，旨在找到1種簡便適用的方法用于提取蟲草樣品中核苷類成分，為準確測定蟲草類真菌核苷類成分含量提供依據和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟬花蟲草采至四川鄉城縣，冬蟲夏草采自青海省玉樹縣，蛹蟲草由云百草實驗室人工培養（菌株分離的野生蛹蟲草，采自云南省昆明市嵩明縣白邑鄉），將上述蟲草材料烘干，粉碎，過80目篩，充分混勻，備用。

尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素等對照品購自Sigma公司，純度為98%以上；甲醇（色譜純，Merck KGaA Darmstadt,Germany）；甲醇（分析純，云南楊林工業開發區汕滇藥業有限公司）；去離子水（Millipore純化系統，Billerica，MA，USA）。

1.2 儀器與設備

戴安ULTIMATE 3000高效液相色譜儀（LPG-3400A四元梯度泵，WPS-3000SL自動進樣器，PDA-3000二極管陣列檢測器，TCC-3000柱溫箱，Waters Symmetry C18色譜柱，5 μm，4．6 mm×250 mm，“變色龍”控制分析色譜工作站軟件）；SK5200超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；50 g手提式高速萬能粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司；電熱水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.3 方法

1．3．1 色譜條件

流動相為甲醇-水（10∶90）；等度洗脫，流速1．0 mL·min-1；檢測波長260 nm；柱溫30℃。在該色譜條件下，尿嘧啶、尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素等對照品色譜峰均能較好地分離，見圖1。

1．3．2 對照品溶液的配制

分別稱取干燥至恒重的尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素等對照品各2 mg，20%甲醇溶解并定容至100 mL。

1．3．3 標準曲線的繪制

分別吸取對照品溶液0．2 μL、0．5 μL、1．0 μL、2．0 μL、4．0 μL、6．0 μL、8．0 μL、10．0 μL、15．0 μL、20．0 μL、50．0 μL、80．0 μL，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定峰面積，以進樣量（換算成對照品重量） 為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）求回歸方程，詳見表1。對照品和樣品HPLC圖見圖1。

表1 核苷類成分的回歸方程、線性系數與檢測范圍Tab．1 Regression equation,correlation coefficient and test range of nucleoside components

1．3．4 樣品處理方法和提取溶劑

精密稱取0．1000 g的蟲草樣品于5 mL離心管中，分別加入提取溶劑純水、10%甲醇、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、80%甲醇、100%甲醇各3 mL，蓋緊，混勻，稱重，分別超聲和80℃熱水浴處理2 h，放至室溫，稱定重量。補充相應溶劑至處理前重量，離心，0．45 μm微孔濾膜濾過，即為供試液，然后按照上述色譜條件測定供試液中10種核苷類成分含量，每個處理3個重復。

1．3．5 超聲提取時間

精密稱取0．1000 g蟲草樣品于5 mL離心管中，分別加入20%甲醇溶液3 mL，蓋緊，混勻，稱重，按提取時間15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min分別超聲處理后，放至室溫，稱定重量。補充20%甲醇溶液至處理前重量，離心，0．45 μm微孔濾膜濾過，即為供試液，然后按照上述色譜條件測定供試液中核苷類成分含量，每個處理3個重復。

圖1 3種蟲草核苷類成分HPLC圖Fig．1 HPLC chromatograms of nucleosides in Cordyceps s．l．

1．3．6 超聲提取次數

精密稱取0．1000 g蟲草樣品于5 mL離心管中，加入20%甲醇溶液3 mL，蓋緊，混勻，稱重，超聲處理90 min，放至室溫，稱定重量。補充20%甲醇溶液至處理前重量，離心，0．45 μm微孔濾膜濾過，編為1號供試液。按此方法，將剩余樣品殘渣再分別處理3次后得到2號、3號和4號供試液。然后按照上述色譜條件測定供試液中核苷類成分含量，每個處理3個重復。

2 結果與分析

2.1 樣品處理方法和提取溶劑的確定

提取溶劑和樣品處理方法見表2。

HPLC測定數據表明，不同的提取溶劑濃度，超聲法對核苷類成分的提取總量均高于熱水浴法，故選取超聲法作為蟲草樣品供試液處理方法。隨著甲醇濃度的提高，無論是采用超聲法，還是熱水浴法，核苷類成分提取總量呈現明顯的下降趨勢。試驗中發現，純水、10%甲醇溶液，在使用0．45 μm微孔濾膜過濾時，難以通過微孔濾膜，這可能是因為其中含有較多的蛋白質和多糖。甲醇濃度為20%時（超聲法），蟬花蟲草的核苷類成分的提取總量為2 029．37 μg·g-1，冬蟲夏草核苷類成分的提取總量為1 972．28 μg·g-1，蛹蟲草的核苷類成分的提取總量為

4 369．28滋g·g-1。雖然核苷類提取量低于純水的提取量，但考慮到試驗的易操作性，將蟲草樣品提取溶劑確定為20%甲醇溶液。

表2 提取溶劑和方法的確定（n=3）Tab．2 Confirmation of extraction solvents and methods（n=3）

2.2 提取時間和次數的確定

提取時間和次數，以及超聲提取次數的確定分別見表3、表4。

表3 超聲處理時間（n=3）Tab．3 Confirmation of ultrasonic treatment time（n=3）

從表3可以看出，超聲提取90 min后，提取液中核苷類成分含量不再有明顯增加，將超聲時間確定為90 min。由表4可知，蟲草樣品中大部分核苷類成分經第1次和第2次超聲即可提取出來，第3次超聲提取液中還可檢測到少量核苷類成分，第4次超聲提取幾乎檢測不到核苷類成分。超聲提取3次可將樣品中98%以上的核苷類成分提取出來，將提取次數確定為3次。

2.3 樣品中核苷類成分含量

根據上述核苷類成分測定數據，確定蟲草樣品供試液制備方法：稱取蟲草樣品0．1000 g左右，提取溶劑為20%甲醇，每次使用提取溶劑3 mL，提取方法為超聲法，提取時間為90 min，提取次數為3次；將3次提取液合并至10 mL容量瓶，定容混勻，0．45滋m微孔濾膜濾過得到供試液。按上述色譜條件測定蟬花蟲草、冬蟲夏草和蛹蟲草樣品中核苷類成分的含量，見表5。

2.4 精密度試驗

精密吸取對照樣品溶液10滋L，按上述色譜條件連續測定5次，獲得各成分峰面積，分別計算相對標準偏差（RSD）。其RSD在0．08%～0．58%。

表4 超聲提取次數（n=3）Tab．4 Confirmation of ultrasonic extraction times（n=3）

表5 3種蟲草樣品中核苷類成分含量Tab．5 Content of nucleosides in Cordyceps s．l．samples

2.5 穩定性試驗

精密吸取對照品溶液10 μL，按照上述色譜條件分別于不同時間測定各成分峰面積，計算相對標準偏差，其RSD在0．16%～3．33%，對照品在48 h內穩定。

2.6 重復性試驗

由于蟬花蟲草和冬蟲夏草中未能檢測到蟲草素，本部分采用蛹蟲草作為供試樣品，分別稱取該樣品0．1000 g共5份，按照“2．3樣品核苷類成分含量測定”的方法處理得到供試液，分別吸取樣品供試液各10 μL，按上述色譜條件測定核苷類成分的峰面積，根據標準曲線將峰面積換算成對照品重量，并計算出樣品中各成分含量，計算相對標準偏差，其RSD在0．78%～3．10%。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取核苷類成分含量已知的蟬花蟲草樣品0．5000 g共3份，分別置于5 mL離心管中，精密稱量。按照“2．4樣品核苷類成分含量測定”的方法，使用對照品儲備液作為提取溶劑，處理得到供試液，按上述色譜條件測定供試液中核苷類成分含量，計算尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素的平均回收率（n=3），回收率平均值在97．37%～102．75%，RSD在1．32%～2．55%。

3 討論

無論是采用超聲法還是熱水浴法，隨著提取溶劑中甲醇含量的逐漸升高，蟲草核苷類成分提取總量由高逐漸降低，表明純水是水溶性核苷類成分最好的提取溶劑。但是，蟲草中含有較多的多糖、蛋白質、氨基酸和脂肪等營養物質[21-23]，如果使用純水作為提取溶劑，蟲草樣品供試液中會含有較多的多糖和蛋白質等雜質，且容易滋生微生物，導致液相色譜儀管路和色譜柱的堵塞。另外，樣品供試液變質后會導致錯誤的結果。高濃度甲醇溶液作為提取溶劑，不僅樣品中核苷類成分提取不完全，其核苷類成分峰形不好，且多有雜峰，因而，采用低濃度的甲醇溶液作為核苷類成分提取溶劑效果較好。

提取溶劑和提取方法的不同，可導致HPLC測定樣品中核苷類成分含量出現較大差異[15]，本研究通過分析核苷類成分提取量與提取溶劑、提取方法、提取次數的關系，找到1種簡單實用的方法，可保證蟲草中核苷類成分提取充分，使得蟲草核苷類成分的測定不受提取條件的干擾，為準確測定蟲草類真菌樣品核苷類成分提供科學依據。

本研究用于測定冬蟲夏草、蛹蟲草和蟬花蟲草等蟲草的水溶性核苷類成分的方法，簡單、方便、高效、靈敏和重現性好，在給定的色譜條件下，尿嘧啶、尿苷、2’-脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2’-脫氧腺苷和蟲草素等核苷類成分分離度良好，能定量檢測這10種核苷類成分，為今后蟲草類真菌水溶性核苷類功效成分質量評價提供了方法和依據。

中國傳統食用冬蟲夏草、蛹蟲草和蟬花蟲草等蟲草類真菌，主要是燉湯后食用[7]。本研究表明，水能有效地提取蟲草中水溶性核苷類成分[21,24]；同時，水也是提取蟲草多糖、蟲草酸的溶劑[25]，這說明我國傳統食用冬蟲夏草及其它蟲草類真菌的方法是科學和實用的。

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An Extraction Method of Nucleosides in Cordyceps s.l.

LI Jian-ping,ZENG Wen-bo
（College of Environment and Resources,Wenshan University,Wenshan 663099,China）

In this study,a suitable method for extracting the nucleosides in Cordyceps s．l．was screened by HPLC,the mobile phase was 10%methanol aqueous solution,the flow rate was 1．0 mL min-1,the detection wavelength was 260 nm,and the injection volume was 10 μL．The contents of uracil,uridine,2’-deoxyuridine,inosine,guanosine,thymidine,adenine,adenosine,2’-deoxyadenosine and cordycepin were determined in the sample solutions,preparing different extraction solvents and extraction conditions．The results showed that the nucleosides were completely extracted,when the extraction solvent was 20%methanol aqueous solution,extraction method was ultrasonic treatment,extraction time was 90 min,and extraction times were 3 times．The extraction condition was suitable for preparing the sample for HPLC determination of nucleosides components,providing a method to determine the nucleosides in Cordyceps-like fungi accurately．

Cordyceps-like fungi;nucleosides;HPLC;extraction

S646.9

A

1003-8310（2017）01-0041-08

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．01．010

李建平（1989-），女，碩士，助教，主要從事蟲草生物資源開發與利用。E-mail:lijianping0426＠126．com

*通信作者：曾文波（1982-），男，博士，講師，主要從事蟲草生物資源研究。E-mail:zengwenboherb＠163．com

2016-11-11