新型抗菌肽類蛋白物質及生物清創在獸醫臨床的應用與推廣

何喜權

【摘 要】近年來，抗菌藥物的研發工作一直進展緩慢。不過，最近發現的兩種可用于治療革蘭氏陽性菌感染的新型抗菌肽卻讓人眼前一亮。目前，全球濫用抗生素的情況嚴重，有學者曾憂心地提出——由于人類在與細菌的“軍備競賽”中總是處于被動和落后的態勢，當有朝一日人類研制的最強效的抗生素都因為超級細菌的存在而失效時，這個世界將會變成什么樣子呢？不過，最近科學家發現的一種可用于治療革蘭氏陽性菌感染的新型抗菌肽，可望為一直進展緩慢的抗菌藥物研發工作增添一份信心。

【關鍵詞】新型抗菌肽；抗菌；革蘭氏陽性菌

[Abstract] Recently scientists have found a kind of can be used in the treatment of gram-positive bacteria infection of new antibacterial peptides， which is expected to work for antimicrobial drug development has been slow to add a confidence.

[Key words] a new antibacterial peptide； antibiosis； gram-positive bacterium

蠅類的幼蟲---蛆蟲對感染創口的清潔作用很早就引起人們的注意。上世紀二、三十年代，在美國和歐洲一些國家蛆蟲清創治療被廣泛應用于各種化膿性感染的創面，包括：膿腫、燒傷、壞疽和慢性腿部潰瘍，取得了良好的臨床效果，臨床治愈率達到90%。但由于抗生素和各種滅菌溶液的問世，活體蛆療熱很快就過去了。

由于抗生素的濫用導致細菌耐藥，創面由于嚴重感染不愈合的現象增多。這些難治性頑固感染創面是臨床常見病，病因復雜，癥狀多變，創面久不愈合，重者致殘，給畜牧養殖帶來極大的不便，也給畜牧場主帶來了經濟負擔。這些病癥大都對抗生素不敏感，而且由于感染與腐爛，導致局部解剖結構變異，神經血管等重要組織外露，治療時，肉眼不能有效分辨壞死組織和正常組織，使手術清創達不到理想效果，而后影響生長發育和繁殖，這類病畜最后大多以只能淘汰為告終。

1 肽類蛋白簡介

1.1 肽類蛋白相關概念

通過離子交換與分子篩層析技術將活體醫用無菌絲光綠蠅蛆蟲血淋巴分泌物的有效抗菌成分提取出來，研究此提取液對感染創面常見細菌的抗菌作用，在國際上首次證實絲光綠蠅蛆蟲血淋巴分泌物提取液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較強的抗菌作用，其抗菌能力強于頭孢哌酮，該抗菌成分為新型抗菌肽類蛋白物質。

1.2 肽類蛋白國內外的研究進展

10年前，科學家們在體外實驗中發現，由8種密切相關的酰基縮肽（ADEPs）組成的復合體具有抗葡萄球菌和抗鏈球菌的作用。最近，拜耳公司抗感染藥物研究部的哈瑞爾及其同事在《自然醫學》雜志上對上述復合體中的主要肽類成分ADEP1的結構進行了詳細描述。為了進一步提高ADEP1的抗菌活性，研究者們還對ADEP1的結構進行了優化，從而得到另外兩種酰基縮肽物質ADEP2和ADEP4。同時，研究者們還在文章中公布了ADEP2和ADEP4的整個合成路線（Nature Med. 2005，11：1082～1087）。

在隨后進行的體外實驗中，研究者證實ADEP2和ADEP4的抗革蘭氏陽性菌活性均比ADEP1有所提高。在幾種不同動物模型上進行的實驗表明，ADEP2和ADEP4治療糞腸球菌感染的療效與口惡唑烷酮類抗菌藥物利奈唑胺相當；此外，研究者們還發現，ADEP4治療膿毒癥的治愈率可達到80%，治療肺炎鏈球菌感染的有效率也超過了利奈唑胺。

通過篩查耐ADEP1變異大腸桿菌庫，研究者們找到了ADEPs的作用靶點，即高度保守的細菌酪蛋白水解激酶（caseinolytic kinase，ClpP）的催化核心。進一步的研究顯示，ADEPs可與ClpP相結合，同時還能使其他非活性Clp-蛋白酶復合體發生蛋白水解。上述研究結果表明，ADEPs主要是通過破壞細菌蛋白正常水解過程而發揮其抗菌作用的。

1.3 抗菌肽類蛋白物質的創新點

1.3.1 在國內首次證實活體蛆蟲分泌物對感染創面常見細菌具有有效的抑制作用 將具有活力的蛆蟲蟲體消毒處理后，對蛆蟲體表經細菌和病毒學檢驗證實無細菌和病毒存在，將消毒的蛆蟲用于嚴重難治性感染創面的臨床治療，所有病例創面膿性壞死組織清除干凈，新鮮的肉芽組織迅速生長，創面表面培養無細菌。筆者認為，蛆蟲在潰瘍創面上爬行，吞食膿性壞死組織、清潔創面的同時，環境中的細菌也進入蛆蟲體內，刺激蛆蟲機體產生抗菌蛋白物質，消滅細菌。

1.3.2 首創性發現蛆蟲生物清創的有效作用機理 我們通過研究首次證實活體蛆蟲能夠有效促進難治性頑固感染創面的愈合、預防細菌感染。發現蛆蟲生物清創的有效作用如下：（1）創面滲出液對細菌有機械沖洗作用。由于活蛆的不斷蠕動刺激創面產生漿液性滲出，創面定殖的細菌被不斷產生的滲出液機械沖洗，并由吸水性敷料吸附，在更換輔料的同時創面細菌隨之被清除。（2）蠅蛆蠕動的機械刺激促使成纖維細胞產生膠原和纖維蛋白沉積，加速肉芽組織的生成。（3）創面壞死組織作為蠅蛆的食物被攝取或被酶解、液化。（4）蠅蛆攝取并消化創面定殖的細菌。

1.3.3 在國內首次將活體蛆蟲應用于臨床頑固性難治感染創面的清創治療 潰瘍、外傷感染創面以及褥瘡等頑固性難治感染創面是臨床常見疾病，病因復雜，創面久不愈合，重者致殘，損害經濟價值，給畜主帶來了經濟負擔。這些病畜大都對抗生素不敏感，而且由于感染與腐爛，導致局部解剖結構變異，神經血管等重要組織外露、健康與壞死組織界限分辨不清，很難通過普通的外科清創術達到根治的目的，這類病畜最后大多以淘汰告終。本項目在國內首次將活體蛆蟲應用于臨床感染創面的清創治療，成功挽救了這類病畜的肢體，有效修復了創面。給臨床外科清創提供了新的技術手段，為生物治療領域提供了新思路。國內多家醫院已經開始應用這種生物清創療法，本項目具有巨大的經濟與社會效益。

2抗菌肽類蛋白物質在臨床試驗結果與分析

2.1 肽類蛋白的制取與來源

2.1.1活體蛆蟲的無菌處理 于喂養的2～3d取出蛆蟲。先用生理鹽水反復沖洗，將幼蟲分別放在3.5%甲醛生理鹽水溶液中5min；放入2%的雙氧水溶液中3min；放入5%的碘仿溶液中；放入5%的含氯的消毒液中；放入75%的酒精中3min，不影響蛆的生活力。我們設計連續用以上濃度的甲醛、雙氧水和含氯的消毒液對蛆進行處理，每次處理完畢后用蒸餾水洗滌，對消毒的蛆體表面經細菌和病毒學檢驗證實無細菌和病毒存在并且蛆的活力仍然存在，無菌狀態可用于活體臨床與基礎實驗。

活體蛆蟲分泌物的獲取

2.1.2活體蛆蟲分泌物（肽類蛋白）的獲取 取適量蛆蟲（600條），分為金葡菌誘導組（將300條幼蟲與金葡菌共培養48h）和對照組，分別加入2倍體積TNE緩沖液（10 mM Tris-HCl， pH 7.5 ，150 mM NaCl， 5 mM EDTA，及蛋白酶抑制劑混合物含10μg/ml leupeptin，1μg/ml aprotinin，and 1mM PMSF，3mM Na3VO4）冰浴10min，充分勻漿勻漿液離心（12000Xg，4OC，10min） 取上清液，加3倍體積的TNE緩沖液，沸水浴2min離心（12000Xg， 4OC，10min）取上清液，即為粗提物。從粗提物中再通過過濾、離心等分離得到一種防御素。防御素是存在于動物和高等植物中的一類富含半胱氨酸的天然抗菌肽，它們對多種微生物均具有較強的防御能力，因此，防御素也是目前頗具吸引力的一類新型候選抗菌藥物。

2.2 肽類蛋白物質的理化性質

抗菌物質對熱穩定，在 100°加熱10min還能保持一定活力，對較大離子強度，較低或較高的PH都有較強的抗性的能力。

2.3 獸醫臨床試驗結果與分析

快速活性測定方法：用金黃色葡萄球菌作為指示菌，采用平板抑菌圈法檢測抗菌物質活性抑菌活力測定。 在營養瓊脂培養基上接種金黃色葡萄球菌，在直徑為四毫米的藥敏片上滴加抗菌提取物，370C，與金葡菌共培養18h，觀察并測量抑菌圈直徑。

3 結語與討論

結果分析表明。抗生素治療具有局部濃度高的優點，但局部應用容易導致細菌耐藥，本實驗中頭孢哌酮對從臨床分離培養出的金黃色葡萄球菌的抗菌作用較弱證明了這一點。昆蟲具有特殊的免疫防御體系，多種昆蟲受到外界有害刺激誘導時能產生體液免疫物質。蒼蠅幼蟲生活在病原微生物較多的環境中，但它自身則不得病，可見蠅體自身具有獨特的免疫防御體系。實驗中采集的蛆蟲血淋巴分泌物提取液對金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌作用，其抗菌能力強于頭孢哌酮。我們認為有害細菌在一定程度上起到了誘導作用，刺激蛆蟲的機體防御體系產生抵抗這種細菌的物質。絲光綠蠅幼蟲（蛆）主要生長在腐尸和腐爛的魚肉等含有大量細菌的環境中，以腐敗組織為食物，對有血運的活體組織無任何影響。國外一些學者利用絲光綠蠅幼蟲的這一特性將其應用于感染創面的修復治療中，取得良好效果。我們將具有活力的蛆蟲蟲體消毒處理后，對蛆蟲體表經細菌和病毒學檢驗證實無細菌和病毒存在，將消毒的蛆蟲用于糖尿病足部潰瘍創面的臨床治療，所有病例創面膿性壞死組織清除干凈，新鮮的肉芽組織迅速生長，創面表面培養無細菌。我們認為，蛆蟲在潰瘍創面上爬行，吞食膿性壞死組織、清潔創面的同時，環境中的金黃色葡萄球菌也進入蛆蟲體內，刺激蛆蟲機體產生某種抗菌蛋白物質，消滅細菌。

蠅蛆僅僅蠶食腐敗組織，面對活組織無任何影響，其療效對病灶的血運沒有要求，蛆蟲容易得到而且非常經濟。蛆蟲療法是一種修復嚴重感染創面的、安全有效的生物擴創療法。醫學的發展使我們對疾病的治療有了更多的選擇，但是當代的醫師有時也會遇到特殊環境下的特殊患者的特殊傷口，需要特殊的治療，這種非常規的治療方法蛆療法，還需要進一步深入研究。

參考文獻：

[1] Harald Labischinski.自然醫學[J].Nature Med. 2005，（11）：1082～1087.

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