一步獲取基因定點修飾技術測序樣品雙峰中突變序列方法的建立

賴婭娜，周 洲

(1.南京醫科大學，江蘇南京 211166；2.南京師范大學，江蘇南京 210023)

一步獲取基因定點修飾技術測序樣品雙峰中突變序列方法的建立

賴婭娜1，周 洲2*

(1.南京醫科大學，江蘇南京 211166；2.南京師范大學，江蘇南京 210023)

介紹了一種經濟高效獲取突變序列的方法。該方法克服了傳統的基因定點突變樣品雙峰測序峰圖分析工作量大、操作繁瑣、結果判定周期長等問題，通過與野生型序列的對比分析，判定突變類型，直接獲取突變型基因序列，從而為基因定點突變技術中快速篩選、確定陽性樣品及其研究奠定理論基礎。

序列分析；基因定點修飾技術；突變序列

近年來，隨著DNA剪輯技術的快速發展，ZFN、TALENs、Crispr/Cas9等技術在越來越多的實驗室得到運用和開展[1-5]。鑒別獲取的突變樣品表型是否有意義，首先要在目標基因靶點兩端設計引物，進行PCR擴增并純化，然后用PCR引物或新合成的引物對純化后的樣品進行測序，若結果顯示目標靶點附近出現套峰，則判定為DNA剪輯技術作用過的樣本。若要進一步明確具體的模板堿基改變是否有意義(移碼或提前終止)，可通過擴增獲取測序套峰樣品的目標基因片段PCR產物，將其克隆到質粒(如T載體)，篩選陽性單克隆測序或將PCR產物進行PAGE膠純化(片段大小差別大，至少瓊脂糖充分電泳后能夠實現切膠純化)后再進行測序。

克隆測序存在操作繁瑣、工作量大、周期長以及費用高等問題；而切膠純化在實際操作時又存在很多困難，其原因在于基因剪輯技術得到的新基因型在序列缺失/增加堿基數量與野生型相差不大，因此切膠純化僅針對一部分大片段剪輯缺失的樣本進行操作。筆者通過總結近年來實際操作的經驗，介紹一種快速、經濟、便捷的方法。該方法通過直接對樣品PCR產物測序雙峰進行分析，無需其他試驗操作，一步即能實現突變基因型序列的獲取。

1 一步法從雙峰圖中獲得突變序列的原理和步驟

樣品在特定位點出現突變，當檢測到測序位點時，由于該位點除野生型對應的堿基組成外還有與野生型不同突變型堿基組成。因此在該位點表現出2種或2種以上不同堿基組成對應的雙峰或重疊峰。如果樣品中僅有堿基替換引起的突變，測序峰圖在突變位點除野生型在該位點為重疊峰，突變點上下游序列均與野生型一致的單一測序峰型；當樣品中存在序列缺失/增加時，樣品峰圖在該位點前表現為單一測序峰型，該位點后由于突變造成整段后續序列的移碼，因其與野生型堿基序列不同造成靶位點后均為雙峰峰型。因此，操作者要得到突變序列，讀取峰圖時首先要辨別特定位點與野生型不同的堿基類型，當單峰因位點與野生型該位點的堿基類型相同即可直接記錄，讀到雙峰時記錄與野生型不同的堿基型，如此反復逐一記錄即可獲取靶位點后的完整突變堿基序列。

盡管通過上述原理的分析，可以采用機械的方法，獲得僅存在一種堿基改變情況下的樣品突變型序列。但實際工作中，序列獲取在操作過程中有一定的技巧。通過突變類型的判斷，根據堿基突變的類型(堿基替換、堿基的增加以及堿基的缺失)，可以利用簡單的方法，更快地獲得所需要的突變序列。

2 實例分析

2.1 相同數量堿基替換引起的突變 基因定點編輯技術引起堿基改變后的序列與野生型對應序列的堿基數量相同，可視為個別堿基替換引起的突變。此類突變測序峰圖的特征：測序序列的長度不變，峰圖上下游因序列重合表現為大片段的單一峰，中間序列由于出現與野生型相同數量的堿基改變，而表現出短片段(通常幾個堿基)雙峰。表現形式為長片段單峰-短片段雙峰-長片段單峰。

堿基替換引起突變的典型測序峰見圖1，圖1a為突變位點前的部分單一峰，圖1b為突變位點為雙峰的一段峰圖，圖1c為突變位點后測序序列末梢的一段單一峰。對突變序列圖1a、1c的序列可直接讀取，圖1b野生型的序列為AAAAGTTACTT，突變的序列排除野生型的峰型，雙峰位點處野生型的堿基序列為AG，記錄與之不同的堿基GT，將GT替換掉野生型該位點的AG，最后此段突變型的序列為AAAGTTTACTT。

圖1 堿基替換引起突變的典型測序峰Fig.1 The typical peak of the mutation induced by base substitution

2.2 樣品中個別堿基缺失引起的突變 在堿基缺失的情況下，由于突變序列比野生型序列短。因此，操作者在判斷突變類型時，發現整段序列與野生型序列等長，即測序序列終止的位點與野生型序列應終止的位點一致，峰圖上游是一段單峰序列，雙峰的序列較長，從突變起始位置延續至測序峰圖尾端(圖2a、2b)，序列末端雙峰結束后有一段單一序列。具體表現為長片段單峰-長片段雙峰-短片段單峰(測序峰圖結束位點與野生型序列等長)。

通過比較圖2b、2d，即野生型與突變型峰末端的序列，突變型序列結束的位點在478 bp處，相比野生型482 bp的長度少4 bp，該突變類型可判斷為堿基缺失。由圖2a、2c可知，野生型序列為CGGGTGGAACTGTGTTAC，突變型部分序列為CGGAACTGTGTTAC，突變型比野生型序列少GTGG 4個堿基，向下游選取特定位置再進行驗證，發現突變型整體序列相對于野生型均向前移動4個堿基，由此即可獲取突變型整段基因序列。

圖2 堿基缺失引起突變的典型測序峰Fig.2 The typical peak of the mutation induced by base deletion

2.3 樣品中個別堿基增加引起的突變 在堿基增加的情況下，突變型序列獲取的方式與堿基缺失引起突變的方式相似。由于突變序列比野生型序列長，在測序峰圖上表現為雙峰結束的位點比野生型序列應結束的位點長，而該位點下游有一段與野生型末端序列相同單一測序峰出現(圖3b)。具體表現為長片段單峰-長片段雙峰(雙峰結束位點與野生型序列等長)-短片段單峰。

3 討論

該研究列舉了3種典型表現形式的雙峰測序峰圖，符合其特征的峰圖都可以按照其圖譜特征，判定樣品突變類型，獲取完整突變序列。在實際工作中，有時會遇到其他類型的雙峰突變，當樣品中的2種突變均為堿基缺失時，峰圖的整體特征是雙峰結束的位點在野生型序列應結束的位點上游，不同之處是下游單峰測序峰圖的結束位點比野生型結束的位點短。樣品中的2種突變均為堿基增加時，雙峰結束的位點比野生型序列應結束的位點長。而當樣品中的2種突變，一種為堿基增加而另一種為堿基減少時，峰圖則表現為雙峰結束的位點在野生型序列應結束位點上游，單峰測序峰圖的結束位點在野生型結束位點的下游。應用過程中，僅需要通過觀察峰圖特征判斷突變類型，再選取雙峰下游幾個位點進行驗證，如均符合移碼突變序列改變的規律，即可得到突變型基因的整段序列。

關于定點突變技術得到的品系樣品，通過傳統方法明確測序雙峰陽性樣品的突變序列還要進行大量的試驗工作，通常要幾天才能完成。而該方法對測序雙峰樣品圖譜進行直接分析，即可在幾分鐘快速明確突變類型(堿基缺失、增加或者替換)，獲取具體改變的堿基數目和序列，大大縮短了試驗步驟和周期，提高了工作效率，節約了試驗成本，為開展基因定點突變提供了一種行之有效的分析方法。

圖3 堿基增加引起突變的典型測序峰Fig.3 The typical peak of the mutation induced by the increase of the base

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One Step Analysis of Mutation Sequences in Two Peak Sequencing Samples Obtained by the Site-directed Mutagenesis

LAI Ya-na1,ZHOU Zhou2*

(1.Nanjing Medical University, Nanjing, Jiangsu 211166;2.Nanjing Normal University, Nanjing, Jiangsu 210023)

A quick method to obtain the sequence of mutation was mtroduced. The traditional sequence analysis method of site-directed gene mutagenesis had the problems such as complicated operation, long result determination cycle and high cost of research.Mutations in the sequence and the type of mutation could be obtained by direct comparison with the wild type sequence. As a result, this method could obviously improve the work efficiency and also provided an economical and efficient sequence analysis for the selection of positive samples of gene site mutation technique for researchers.

Sequence analysis;The site-directed mutagenesis;Mutatim sequence

賴婭娜(1979- )，女，四川綿陽人，助理實驗師，碩士，從事實驗動物技術方面的研究。*通訊作者，高級實驗師，碩士，從事細胞與遺傳學實驗技術方面的研究。

2016-11-04

S 188

A

0517-6611(2016)34-0152-02