中藥復(fù)方提取液對痤瘡常見細菌抑菌作用及最低抑菌濃度的研究

廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院

王俊杰 陳艷婷 鄧偉民(廣州 510000)

中藥復(fù)方提取液對痤瘡常見細菌抑菌作用
及最低抑菌濃度的研究

廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院

王俊杰 陳艷婷 鄧偉民(廣州 510000)

目的：研究中藥復(fù)方提取液對痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的抑菌效果及最低抑菌濃度(MIC)。 方法: 采用微量稀釋法(試管5倍稀釋法)分別測定中藥復(fù)方提取液對痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的MIC。每組采取兩個重復(fù)，凡清澈透明的試管判為無菌生長，以無菌生長的最高藥物稀釋度(最低藥物濃度)為該藥對試驗菌的MIC。 結(jié)果:與對照組相比，各實驗組試管渾濁減輕；進一步測得中藥復(fù)方提取液對痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的MIC分別為1/10 ～1/5、1/50～1/25、1/75～1/50。 結(jié)論: 中藥復(fù)方提取液對痤瘡3種細菌有較好的抑菌效果,為臨床中醫(yī)藥治療痤瘡提供實驗依據(jù)。

中藥復(fù)方提取液；痤瘡；粉刺；最低抑菌濃度；丙酸桿菌；金黃色葡萄球菌；表皮葡萄球菌

痤瘡是一種在青少年和成人中常見的毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，是多種因素綜合作用所致的毛囊皮脂腺疾病，最常發(fā)生于青年男女皮膚表面，尤其顏面，容易引起凹陷、毛囊孔粗大、色素沉著、疤痕等永久性皮膚損害，給患者造成嚴(yán)重的心理負擔(dān)，所以痤瘡的防治日益受到重視。中醫(yī)稱之為“肺風(fēng)”“粉刺”“嗣面”“酒刺”或“面疤”。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，其發(fā)病與痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等[1]密切相關(guān)。對菌群異常引起的炎癥性痤瘡，西醫(yī)抗菌素治療效果不錯，但菌株耐藥性問題發(fā)生普遍，使中醫(yī)藥治療痤瘡具有獨特的優(yōu)勢，筆者通過對中藥復(fù)方提取液微量稀釋，檢測3種常見細菌抑菌效果及最小抑菌濃度(MIC)測定，為臨床中醫(yī)藥抗菌治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ⑴實驗菌株：痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌ATCC29243、表皮葡萄球菌；⑵藥物：中藥復(fù)方提取液藥粉(由金銀花、野菊花、玫瑰花、側(cè)柏葉等純中藥按一定比例)由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院提供；⑶提取液制備：經(jīng)由洛捷公司采用低溫高壓差提取技術(shù)獲得1︰3(藥粉重量︰提取液重量)提取液；⑷試劑與儀器：培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(LB)，液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FT)；牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，瓊脂；烘箱，滅菌鍋，冰箱，接種用具，恒溫搖床，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，超凈臺，721分光光度計；其他試劑：10 mL試管，5 mL、1 mL、200 μL槍頭及加樣槍，膠頭滴管，凡士林，厭氧培養(yǎng)罐及恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 最小抑菌濃度(MIC)測定(試管5倍稀釋法): 取帶棉塞的滅菌試管8只為1列。 每只試管添加稀釋后的菌液 4 mL , 然后向第1只試管中添加 1 mL待檢藥物溶液( 見表1) , 混勻后吸取 1 mL 加入第2管中, 同法依次稀釋至第7管, 棄去 1 mL, 第8管作為生長對照。置37℃培養(yǎng)16～18 h，觀察是否有菌生長 。每組采取兩個重復(fù)，凡清澈透明的試管判為無菌生長，以無菌生長的最高藥物稀釋度(最低藥物濃度)為該藥對試驗菌的MIC。

1.2.2 用連續(xù)試管稀釋法對模式菌株進行MIC測定 葡萄球菌采取LB培養(yǎng)基，在測定MIC前1 d活化菌種，從保種的固體培養(yǎng)基挑取單菌落接種到LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)18 h，然后將處于對數(shù)生長期的活化菌液用微量移液器取50 μL到已做好藥劑稀釋的培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)18 h后觀察抑菌效應(yīng)。痤瘡丙酸桿菌的MIC測定：用滅菌接種環(huán)挑取痤瘡丙酸桿菌菌種管液體，接種至FT培養(yǎng)液，加熱已滅菌凡士林至溶解，待溫度下降后傾倒到培養(yǎng)管中密封，置于厭氧培養(yǎng)箱，并使用厭氧發(fā)生袋，厭氧37℃培養(yǎng)48 h，再用微量移液器取50 μL接入到已添加藥劑稀釋的培養(yǎng)液后厭氧培養(yǎng)，48 h后觀察抑菌效應(yīng)。

1.3 結(jié)果判斷 以第7管陰性對照管、第8管生長對照管為參照, 記錄 1～7管細菌生長情況。 試管中培養(yǎng)基混濁記為有菌, 澄清記為無菌, 以同種細菌兩列管無菌生長的最低濃度的平均值為MIC。 因藥液顏色影響無法觀察結(jié)果的, 用接種環(huán)勾取培養(yǎng)液接種到營養(yǎng)瓊脂表面，37℃培養(yǎng)24 h 后凡是有菌生長的記為有菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥復(fù)方試驗 (1)以中藥復(fù)方原液(1︰3)進行5倍稀釋，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示8號試管(無菌生長對照管)澄清，7號試管(無藥細菌生長對照管)混濁；與7、8號試管對照，兩組平行試管均從3號管開始均出現(xiàn)渾濁，4、5、6號管混濁較7號試管減輕，即 1/125 < MIC <1/25。(2)在稀釋度為25～125中，進行25、50、75、100、125的稀釋度稀釋，其結(jié)果顯示與7、8號試管對照，兩組平行試管均為3號管開始出現(xiàn)渾濁。

綜上所述，中藥復(fù)方提取液對金黃色葡萄球菌的MIC為稀釋度1/50< MIC <1/25。

表1 中藥復(fù)方提取液(1︰3)稀釋度對金黃色葡萄球菌MIC

2.2 中藥復(fù)方提取液對表皮葡萄球菌的抑制效應(yīng) 重復(fù)2.1試驗，得出對表皮葡萄球菌的MIC為稀釋度1/75< MIC <1/50。

2.3 中藥復(fù)方提取液對痤瘡丙酸桿菌的抑制效應(yīng) 使用厭氧培養(yǎng)法和FT培養(yǎng)基，重復(fù)2.1試驗，對中藥復(fù)方進行痤瘡丙酸桿菌的MIC測定，根據(jù)菌體生長情況得出中藥提取物對痤瘡丙酸桿菌的MIC為稀釋度：1/10 < MIC<1/5。

2.4 試驗主要采取稀釋量對中藥提取物的MIC進行描述 中藥提取物(1︰3)對不同痤瘡模式微生物的MIC試驗結(jié)果是金黃色葡萄球菌為1/50～1/25，表皮葡萄球菌為1/75～1/50，痤瘡丙酸桿菌為1/10～1/5，有關(guān)生藥量等數(shù)據(jù)也可直接折算出來。

3 討論

痤瘡是一種毛囊及皮脂腺的慢性炎癥性疾病，病因復(fù)雜，發(fā)病機制尚不明確，目前公認(rèn)系多因素致病，痤瘡發(fā)病多與遺傳有關(guān)，同時環(huán)境因素如空氣質(zhì)量、粉塵、日曬、空氣濕度對其影響顯著，此外，不良的生活習(xí)慣，現(xiàn)在上班族表現(xiàn)明顯，如熬夜、焦慮、工作壓力大、嗜食辛辣、大量飲酒等，對皮膚刺激性較大，導(dǎo)致皮膚抵抗力下降，皮膚自我修復(fù)能力降低，使得痤瘡不斷發(fā)生發(fā)展，遷延難愈；痤瘡主要累及表皮和毛囊皮脂腺單位(PSUs)，其發(fā)病機制主要包括四大因素：毛囊及皮脂腺導(dǎo)管上皮的過度角化，異常菌群，皮脂腺分泌過多以及炎癥反應(yīng)。[2]其中微生物感染的異常菌群主要有痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌密切相關(guān)，少數(shù)痤瘡與糠秕馬拉色菌有關(guān)。其中主要以痤瘡丙酸桿菌為主，其次金黃色葡萄球菌，西醫(yī)對此以抗菌素抗感染治療為主，現(xiàn)今治療痤瘡的許多內(nèi)用和外用藥物都屬于抗菌素類或其它抗菌藥物,效果也十分確切顯著，但也導(dǎo)致了細菌耐藥性的普遍發(fā)生，且抗菌素對于痤瘡引起的皮膚瘢痕是沒有治療效果的，[3]對于非菌群感染引起的痤瘡，西醫(yī)主要以維A酸類抗皮脂腺導(dǎo)管異常角化、糖皮質(zhì)激素抗炎、抗雄激素等，治療效果并不十分理想，臨床可見其病程遷延，容易復(fù)發(fā)，中醫(yī)藥在這方面治療效果值得肯定，痤瘡屬于中醫(yī)學(xué)“粉刺”范疇，中醫(yī)認(rèn)為痤瘡病機不外乎熱、濕、毒三邪單獨或相挾致病，楊氏[4]通過對中醫(yī)治療痤瘡的文獻的分析，發(fā)現(xiàn)痤瘡的中醫(yī)分型主要有肺經(jīng)風(fēng)熱、胃腸濕熱、痰濕瘀滯等，臨床治療以清熱解毒、利濕化痰、活血化瘀等法為主，取得良好的治療效果。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，中藥具有明顯的抗皮脂腺分泌，抑制毛囊的過度角化及局部炎癥反應(yīng)，效果不錯，臨床治療須因人而異，辨證論治。除了中醫(yī)藥內(nèi)服治療，中藥外用的皮膚護理對減輕痤瘡癥狀特別是痤瘡后期遺留的瘢痕、色素沉著等慢性并發(fā)癥效果明顯，如潔面乳，面膜等，美容的同時修護皮膚，筆者主要研究中藥復(fù)方提取液對常見病菌的抑菌效果，從而在中藥面膜研發(fā)中發(fā)揮更好的護膚效果。

本中藥復(fù)方提取液以花類藥為主，花類藥在皮膚病方面應(yīng)用廣泛，[5]其中金銀花、野菊花在痤瘡方面具有很好的治療效果，中醫(yī)認(rèn)為金銀花、野菊花屬寒涼之品，為清熱解毒藥之上品，吳氏[6]等人通過對金銀花、野菊花中提取的活性成分綠原酸、異綠原酸、肌醇、鞣質(zhì)、野菊黃酮甙、野菊內(nèi)酯等，進行動物實驗及臨床研究，發(fā)現(xiàn)二者皆有顯著的抗菌、抗病毒、抗炎以及促進白細胞吞噬等功能，兩者合用對痤瘡治療效果明顯；玫瑰花具有很好的美容養(yǎng)顏功效；[7]該中藥提取物對痤瘡的皮膚護理領(lǐng)域如祛痘面膜，有很好的治療及美容效果；側(cè)柏葉具有很好的抗菌效果，尤其對金黃色葡萄球菌具有很好的抑菌效應(yīng)，同時側(cè)柏葉總黃酮提取物對中性粒細胞 LTB4 及 5-HETE 生物合成有較強的抑制作用，具有較強的抗炎作用，[8]此外側(cè)柏葉還具有抗氧化、凝血等功效，在臨床皮膚病領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。綜上，此中藥復(fù)方提取液以花、葉類中藥為主，輕清宣透，上于頭面，芬芳宜人，對皮膚刺激小，藥物的有效成分容易透皮滲入，廣泛應(yīng)用于美容和保健領(lǐng)域。

在前期祛痘面膜產(chǎn)品初步研發(fā)中，中藥復(fù)方提取液(1︰3)在面膜液的添加量曾使用過10%、20%、30%、40%和50%的添加量，但在小規(guī)模試用中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取液濃度超過30%后，面膜液對使用者的面部皮膚有刺激及不適感，具體描述為針刺感；且面膜液色澤偏黃中藥味較重，使用者難以產(chǎn)生愉悅感。本次抑菌試驗基本表明，當(dāng)中藥提取物(1︰3)稀釋度在1/10 ～1/5，即在面膜液中的添加量介于10%～20%之間，中藥提取物達到對幾種模式細菌的MIC，證明該提取物在面膜液的低濃度添加即有良好的抑菌能力，而在該添加濃度范疇內(nèi)，面膜液澄清，多名受試者沒有反映有刺激感。抑菌試驗和相關(guān)MIC結(jié)果證明，該中藥復(fù)方提取液適合進一步推進中試行量產(chǎn)。

本次試驗仍有一些不足地方，一是中藥復(fù)方提取液是多種中藥多組分的混合物，雖然通過此次實驗證明中藥復(fù)方提取液對多種細菌都具有較強抑制作用, 但是其抑菌有效成分還有待于繼續(xù)研究, 抑菌機理也尚不明確，須待進一步分析。二是本研究使用的痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌都是制藥廠的標(biāo)準(zhǔn)菌株, 中藥復(fù)方提取液對這3種細菌都表現(xiàn)出較強抑制作用, 其對臨床中分離的痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌是否同樣有效還需深入研究。三是中藥復(fù)方提取液對3種細菌的最低抑菌濃度為一個范圍，應(yīng)在此基礎(chǔ)上作進一步稀釋并試驗，得出一個準(zhǔn)確的數(shù)值，以方便作為臨床施用標(biāo)準(zhǔn)。四是糠秕馬拉色菌對臨床上痤瘡病理影響雖然不如上述3種細菌影響顯著，但亦須作進一步研究，為積累和豐富量產(chǎn)前的抑菌數(shù)據(jù)，今后可能會對糠秕馬拉色菌進行MIC的測定。

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(2016-08-14 收稿)

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A

1007-5615(2016)04-0038-03