GSK-3β、E-cadherin、Cytokeratin在口腔鱗狀細胞癌中的表達及意義

馬竹君 馮紅超 宋宇峰 高瓊 孫昊軒

(1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004;2.貴陽市口腔醫院，貴州 貴陽 550001;3.貴州省食品藥品監督管理局，貴州 貴陽 550004;4.貴州醫科大學附屬口腔醫院頜面外科，貴州 貴陽 550004;5.河北省眼科醫院口腔頜面外科，河北 邢臺 054001)

GSK-3β、E-cadherin、Cytokeratin在口腔鱗狀細胞癌中的表達及意義

馬竹君1馮紅超2△宋宇峰3高瓊4孫昊軒5

(1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004;2.貴陽市口腔醫院，貴州 貴陽 550001;3.貴州省食品藥品監督管理局，貴州 貴陽 550004;4.貴州醫科大學附屬口腔醫院頜面外科，貴州 貴陽 550004;5.河北省眼科醫院口腔頜面外科，河北 邢臺 054001)

目的 本實驗通過觀察已確診的口腔鱗狀細胞癌組織中上皮間質化(EMT)相關蛋白及糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的表達，初步探討其在人口腔鱗狀細胞癌中的臨床意義，并研究其在口腔鱗癌及正常上皮組織中上皮間質化中的作用，為口腔鱗狀細胞癌的預防、控制和治療提供一定參考。方法 通過免疫組織化學的方法檢測32例口腔鱗癌組織中上皮源性標記物：上皮-鈣黏蛋白(E-cad)及細胞角蛋白(CK)、GSK-3β的表達情況，并與臨床病理資料作對照分析。結果 在口腔鱗癌組中，GSK-3β、CK及E-cad的表達明顯低于正常組織組(P<0.05)；T4+T3組中，E-cad、GSK-3β的表達明顯低于T1+T2組(P<0.05)；在有淋巴結轉移組中，E-cad、CK及GSK-3β的表達低于無淋巴結轉移組(P<0.05)，E-cad與GSK-3β表達呈正相關(r=0.572，P=0.001)。結論 口腔鱗癌組織中存在上皮間質化現象，E-cad、CK表達減少，GSK-3β在OSCC與正常上皮組織表達中存在差異，GSK-3β的減少可促進OSCC細胞發生EMT，使口腔鱗癌侵襲及轉移，聯合上述3個因子，可能為預測OSCC的轉移及針對OSCC轉移的治療研究提供一定幫助。

口腔鱗癌; 糖原合成酶激酶-3β; 細胞角蛋白; 上皮-鈣黏蛋白; 上皮間質化; 淋巴結轉移

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是口腔頜面部最常見的上皮來源的惡性腫瘤，約占口腔頜面部腫瘤的80%，具有惡性程度高，易向周圍侵襲,淋巴結易轉移，預后差等特點，發病率逐年上升。侵襲和轉移是惡性腫瘤的生物學特性之一[1]，其中OSCC的頸部淋巴結轉移是目前臨床上腫瘤致死的主要因素，嚴重威脅人類的生命及健康。上皮細胞間質轉化(EMT)是指上皮細胞失去上皮表型轉化為間質細胞表型的過程，是一個繁雜有序的、多基因的、可調控的生物學過程，在發育、組織愈合及器官纖維化等過程中起關鍵作用。其特點是上皮細胞標記物如上皮-鈣黏蛋白(E-cad)、細胞角蛋白(CK)的丟失與間質細胞標記物的獲得[2]。隨著研究深入，有研究[3-4]發現，在發生了轉移的胸腺導管癌、結直腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤中，存在EMT現象，與多條信號通路相關[5]，EMT與腫瘤的遷移及侵襲逐漸成為近年來研究熱點。

有研究表明，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)與食道癌、喉癌等許多惡性腫瘤密切相關，而對于GSK-3β及其相關信號通路與OSCC的臨床關系及其與OSCC中EMT的關系的相關研究較少。為了闡明GSK-3β與OSCC的臨床關系與OSCC中是否存在EMT而導致其易轉移的惡性生物學行為及其機制，我們通過免疫組化(PV二步法)的方法對32例口腔鱗癌標本中GSK-3β的表達進行了檢測，同時以免疫組化的方法對EMT標記蛋白：E-cad、CK進行了檢測分析，為了解口腔鱗癌轉移的發展機制提供一定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本選擇 收集貴州醫科大學附屬醫院口腔頜面外科2009-2015年手術切除的，術前未采用任何針對腫瘤的治療，如放療、化療等，經組織蠟塊保存完好的口腔鱗癌標本。均經常規病理檢查確診為鱗狀細胞癌。

1.1.2 臨床資料 口腔鱗癌患者32例，男23例，女9例，年齡42～78歲，平均60歲。高分化21例、中低分化11例。無淋巴結轉移13例，有淋巴結轉移19例，無發生遠處轉移者。另設12例口腔黏膜正常組織作對照。

1.1.3 試劑 小鼠抗人細胞角蛋白(廣譜)、E-cadherin單克隆抗體及DAB顯色試劑盒、免疫組化PV試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，小鼠抗人GSK-3β單克隆抗體購自恩晶生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學染色行PV二步法 組織蠟塊經厚5 μm連續切片，脫蠟水化后，檸檬酸抗原修復液高壓熱處理修復抗原，3%去離子水封閉內源性過氧化物酶分別加入GSK-3β(1∶50)、E-cadherin(1∶100)、細胞角蛋白(1∶100)一抗工作液、4 ℃孵育過夜。加入生物素化二抗，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固。PBS代替一抗做陰性對照。實驗程序嚴格按照試劑說明書進行。另取一張切片行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.2.2 結果判定 免疫組織化學及原位雜交每例切片隨機選擇10個視野(放大200倍)拍照。參考相關文獻以Imagepro-plus圖像分析系統進行平均光密度(MOD)分析，分析中進行了光密度校準及空間標定，按照陽性表達在照片中的范圍在照片中畫出測量區域，即總面積，讀取積分光密度(IOD)數值，作為此張照片的累積光密度值。MOD計算方法為MOD=IOD/Area(Sum)。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0統計軟件分析數據，GSK-3β、E-cad、CK光密度不滿足正態分布，參數檢驗(P>0.05)，故采用中位數及四分位間距M(P25，P75)表示。正常組織與口腔鱗癌組織的光密度的差異，不同臨床特征下GSK-3β、E-cad、CK光密度比較采用Mann-Whitney非參數檢驗，兩樣本比較采用Spearman秩和相關進行相關檢驗。檢驗水準為雙側α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 GSK-3β、E-cad、CK在OSCC及正常組織中的表達

E-cad陽性信號主要位于正常上皮組織細胞膜，少量表達于細胞質(圖1a)，在OSCC組織中多表達于仍存在細胞極性的鱗狀上皮部分，呈淺淡的不均質點狀分布，在大多數癌巢組織無著色表現(圖1b)；CK主要定位于上皮細胞質(圖1c)，相較于周圍上皮組織，癌巢部位CK的表達相對較低(圖1d)。GSK-3β的陽性信號主要定位于正常口腔鱗狀上皮細胞質中(圖1e)，在OSCC組織中表達減少或少數在細胞核中異位表達 (圖1f)。

圖1 免疫組織化學染色結果(SP×20)

2.2 GSK-3β、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達的MOD值

GSK-3β、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達的MOD值見表1，在OSCC組織中，GSK-3β、E-cad及CK的表達明顯低于正常組織(P<0.05)。

表1 GSK-3β、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達的MOD值

2.3 OSCC組織中GSK-3β、E-cad、CK表達與臨床病理資料的關系

在OSCC中，E-cad在有淋巴結轉移組中高于無淋巴結轉移組，在T1+T2分期中表達低于T3+T4分期；CK在有淋巴結轉移組中高于無淋巴結轉移組；GSK-3β在有淋巴結轉移組中表達低于無淋巴結轉移組，在T1+T2分期中表達高于T3+T4分期，以上差異均有統計學意義(P<0.05)；GSK-3β、E-cad表達在不同分化組中差異無統計學意義；CK的表達在不同腫瘤分期中差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 OSCC組織中GSK-3β、E-cad、CK表達與臨床病理資料的關系

2.4 OSCC中GSK-3β、E-cad、CK的相關性

CK與其他指標無相關性，E-cad及GSK-3β呈正相關，相關系數為0.572(P=0.001)。

3 討 論

GSK-3β是一種能磷酸化多種底物的多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶[6]。它可與其他蛋白組成復合物，也可游離散在分布于胞漿中，在成熟的上皮細胞中為活化狀態，通過對底物磷酸化[7]，可作用于眾多信號蛋白、結構蛋白和轉錄因子，調節細胞的分化、增殖、存活和凋亡[8-9]。GSK-3β在多種信號通路中起負性調節作用[10-11]，此外研究[12]還發現，在口腔、肝、前列腺等腫瘤中，GSK-3β具有抑瘤作用，而Chandra等[13]發現，在已發生EMT的侵襲性胸腺導管癌中，GSK-3β在細胞質中表達減少，細胞核中有表達，證實GSK-3β與腫瘤的EMT存在一定關系。E-cad是一類介導同型細胞間黏附的鈣依賴型跨膜糖蛋白，是目前公認的最為經典的上皮細胞標記物[14]，主要參與細胞間連接，維持生理條件下上皮組織的極性和結構的完整性[10]。有研究[15-17]認為，在甲狀腺腫瘤、胃癌、結直腸癌等腫瘤中發現E-cad的表達下調，E-cad的減少或丟失是EMT發生的典型特征，與上皮來源的腫瘤細胞侵襲有密切聯系[18]。CK是另一種上皮細胞特征標記物，其具有多個亞型且不同亞型存在于不同類型上皮細胞的不同階段[19]，已有研究表明在某些人上皮腫瘤中有不同類型的CK的表達。E-cad、CK是目前最常用的監測EMT進程的上皮標記物。

本研究結果顯示，GSK-3β、E-cad、CK在OSCC組織中表達較正常組織低(P<0.05)，這與多數研究結果相似，提示GSK-3β、E-cad、CK的異常表達可能與OSCC發生發展相關，OSCC可能存在EMT現象；E-cad、GSK-3β在T1+T2分期組表達較T3+T4分期組高，提示異常的GSK-3β低表達，可能促進OSCC生長，瘤細胞不易凋亡，腫瘤能順利增殖、分化，E-cad的異常低表達，促使瘤組織細胞間連接越加松散；E-cad、GSK-3β、CK在有淋巴結轉移組表達較無淋巴結轉移組降低，提示E-cad、CK、GSK-3β異常表達與OSCC的淋巴轉移密切相關，三者表達的降低有可能使OSCC發生淋巴轉移的幾率提高。本研究結果顯示，上皮標記物E-cad及CK存在異常低表達，在OSCC組織可能存在上皮間質轉化現象，E-cad與GSK-3β表達呈正相關(r=0.572，P=0.001)，提示GSK-3β的異常低表達可能是OSCC中發生EMT的重要因素，與腫瘤EMT發生密切相關。

有研究[12]表明，GSK-3β在腫瘤細胞中表達減少，對腫瘤的抑瘤作用降低，可以使腫瘤的發生發展獲得一定自由，同時GSK-3β可參與Wnt/β-catenin、FAS等多種與EMT發生機制相關的信號通路，起負性調節作用，其表達減少，有可能促進腫瘤發生EMT現象[20]，使細胞獲得轉移和入侵的能力。OSCC的淋巴轉移及侵襲機制涉及多因素及機制，本實驗通過研究E-cad、CK、GSK-3β在OSCC中的表達，證實在人OSCC中存在EMT現象，通過分析各因子與臨床病理資料之間關系證實，OSCC中GSK-3β的表達水平與OSCC發生發展相關，且GSK-3β與EMT發生有一定關系，其具體如何參與EMT的進程，有待進一步深入研究。GSK-3β的抑瘤及對EMT形成的影響使其有可能成為早期預測腫瘤侵襲轉移的標記蛋白，為提前預測腫瘤的轉移提供新的預測方法及為研究腫瘤的治療方法提供一些新的思路。

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Expression and significance of GSK-3β etc. and relation with epithelial-mesenchymal transition inoral squamous cell carcinoma

MaZhujun1,FengHongchao2,SongYufeng3,GaoQiong4,SunHaoxuan5.

1.GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550004,China. 2.GuiyangCityStomatologicalHospital.Guiyang550001,China. 3.FoodandDrugAdministrationBureauinGuizhouProvince,Guiyang550004,China. 4.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery.AffiliatedStomatologyHospital,GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550004,China. 5.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,OphthalmologyHospitalofHebeiProvince,Xingtai054001,China.

Objective To analysis the expression of GSK-3β and EMT correlated protein to discuss the clinicopathological feature of OSCC and investigate the relationship between EMT and OSCC lymph node invasion or distant metastasis. Methods 32 cases of OSCC and 10 cases of normal human were detected by IHC to explore the expression of GSK-3β and epithelial drived markers: E-cadherin, Cytokeratin. Results In OSCC group, the expression of GSK-3β, Cytokeratin and E-cadherin is significantly lower than those in the normal group (P<0.05, Table 1); the expression of GSK-3β and E-cadherinis in T4+T3 group is significantly lower than T1+T2 group (P<0.05, Table 2). In the group with lymph node metastasis, the expression of GSK-3β, E-cadherin and Cytokeratin is obviously lower than the group without lymph node metastasis (P<0.05,). The expression of GSK-3β, E-cadherin and Cytokeratin had no obvious relationship with patient's degree of tumor differentiation (P>0.05). The expression of GSK-3β and E-cadherin were observed strong positive correlations (r=0.572,P=0.001). Conclusion EMT takes place in OSCC. E-cadherin, Cytokeratin and GSK-3βare differently expressed in OSCC and normal epithelial tissue. GSK-3β may involve the progression of EMT in OSCC, promote infiltraton and metastasis of OSCC. Combined with the above three factors, it may be helpful for predicting the transfer of OSCC and the targeted therapy of OSCC.

OSCC; GSK-3β; Cytokeratin; E-cad; EMT; LNM

貴陽市衛生局科學技術計劃項目 (2014筑衛科技合同字第15號);貴州省科技計劃課題任務[黔科合LG字(2011)001號]

R739.8

A

1000-744X(2016)04-0354-04

2015-09-25)

△通信作者，E-mail：hongchaof@126.com