MMP-2在缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬中的表達及意義

殷杰 陳蓉 肖東凡

(1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫院新生兒科，貴州 貴陽 550002)

MMP-2在缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬中的表達及意義

殷杰1，2陳蓉2△肖東凡1，2

(1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴州省人民醫院新生兒科，貴州 貴陽 550002)

目的 探討在缺氧缺血性腦損傷(HIBD)新生大鼠海馬中基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達及其作用。方法 將7 d齡新生SD大鼠42只隨機分為假手術組及HIBD模型組，后者根據處死時間分為 6 h、12 h、24 h、48 h、3 d、7 d組(n=6)，采用免疫組織化學方法檢測各組大鼠海馬中MMP-2的表達水平。結果 MMP-2蛋白表達量在HIBD后呈逐漸增高趨勢，在24 h至3 d時間段增長趨勢平緩，到7 d時顯著增高達高峰；與假手術組比較，24 h組、48 h組、3 d組、7 d組差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 MMP-2在新生大鼠HIBD后各時間點表達有不同程度的變化，可能參與了HIBD的發生發展。

基質金屬蛋白酶-2； 缺氧缺血性腦損傷； 新生大鼠； 海馬

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是圍產期窒息缺氧引起新生兒死亡及神經發育障礙的原因之一，目前仍無較好的預防及治療措施。其發病機制復雜，其中血腦屏障的破壞及通透性改變導致腦水腫是早期發生的主要病理過程和損害因素。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組Zn2+依賴的蛋白水解酶，主要參與細胞外基質及基底膜的降解和重塑[1]。其中MMP-2是MMPs基因家族中的一個重要成員,對腦損傷后血腦屏障的破壞發揮著重要的調節作用[2]，但最近研究[3-4]表明MMP-2還可能參與了神經損傷的修復，故目前關于MMPs在缺氧缺血性腦損傷(HIBD)后腦組織中的表達研究觀點不一，其作用尚未完全明確。本實驗旨在觀察 HIBD 的發生發展過程中MMP-2在海馬的動態表達變化，以探討其在 HIBD病程中的作用及意義，為臨床治療HIE提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 健康7 d齡SD大鼠(清潔級，母鼠帶養)42只，雌雄不限，體質量8～15 g(購自貴州醫科大學實驗動物中心)，批號: ISCXK(黔) 2012-001。隨機分成假手術組(n=6)、HIBD模型組(n=36)，根據處死時間點HIBD組又分6個亞組：6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d，每個亞組6只。

1.1.2 主要試劑及儀器 兔抗鼠MMP-2單克隆抗體(美國abcam，ab86607)；山羊抗鼠一步法免疫組化聚合物檢測試劑盒(北京中杉金橋，PV-6002)；4%多聚甲醛(武漢博士德，AR1068)；600數顯三用恒溫水浴箱(金壇市友聯儀器研究所)；密閉缺氧艙(上海新華醫院研究所)；8%O2+92%N2混合氣體(貴陽申建氣體公司)；倒置顯微鏡(日本Nikon TE-2000)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備 根據改良Rice法，大鼠乙醚吸入麻醉后，將其仰臥固定于操作板上，常規消毒切開頸部皮膚,分離并結扎左頸總動脈, 縫合切口,待大鼠清醒后置于37 ℃恒溫水浴密閉缺氧艙中，以2 L/min流量向艙內通入8%O2+92%N2混合氣體，2 h后恢復正常供氧并將大鼠送回母鼠身邊喂養。假手術組僅切開頸部皮膚, 分離左頸總動脈后不予結扎, 縫合切口后不做低氧處理。

1.2.2 標本與切片制備 將各組大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后，開胸暴露心臟，自心尖進針向左心室內灌注無菌生理鹽水，同時剪開右心耳，至流出液體清亮，肝臟及肺臟變白后，繼續灌注4%多聚甲醛至大鼠僵硬后，斷頭取全腦組織置于4%多聚甲醛中室溫固定72 h以上。取固定好的腦組織，從視交叉及其后5 mm處行冠狀切面(包括海馬區)，經過脫水、石蠟包埋后，切片(4 μm)，貼片于防脫載玻片上，60 ℃烤片2 h備用。

1.2.3 免疫組織化學檢測 切片常規脫蠟至水，120 ℃乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復液修復2 min；3%H2O2孵育浸泡10 min，阻斷內源性過氧化物酶；PBS沖洗3 min×3次,滴加一抗(MMP-2，1∶100)，濕盒中4 ℃過夜，PBS沖洗3 min×3次；滴加聚合物檢測試劑，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗2 min×3次；滴加DAB顯色試劑顯色，顯微鏡下觀察顯色，自來水適時終止，蘇木素復染，自來水返藍；脫水、透明后封片。以細胞漿著色為黃色或棕黃色判定為MMP-2蛋白陽性表達，高倍鏡下在海馬區隨機取5個視野采圖，利用Image pro plus6.0圖像分析軟件測定積分光密度值(IOD)。

1.3 統計學處理

2 結 果

各組海馬區MMP-2 蛋白表達見圖1，假手術組海馬區可見MMP-2有少量陽性細胞表達(圖1a)，HIBD各組海馬區MMP-2蛋白表達于缺氧缺血后呈逐漸增加趨勢，但在24 h至3 d時間段增長趨勢平緩(圖2)，到7 d時胞漿染色最深(圖1g)，蛋白表達至高峰(圖2)。與假手術組比較，HIBD模型組24 h、48 h、3 d、7 d MMP-2蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠海馬區MMP-2蛋白表達(×400)

圖2 各組MMP-2積分光密度值(IOD)趨勢

組別nMMP2假手術組698．8±23．3HIBD6h組6109．5±28．3HIBD12h組6127．5±9．1HIBD24h組6135．6±20．2?HIBD48h組6138．5±15．5?HIBD3d組6156．4±25．1?HIBD7d組6206．7±20．8?#

注：與對照組比較，*P<0.05；與HIBD模型組前一時間點比較，#P<0.05。

3 討 論

MMPs是一類鋅依賴性蛋白水解酶家族，研究[5]表明，該家族中MMP-2對細胞外基質分子的降解及其對血腦屏障的破壞與腦損傷密切相關。MMP-2即明膠酶A，在中樞神經系統中主要由神經元、腦血管內皮細胞、神經膠質細胞、巨噬細胞等合成和分泌，其作用底物包括膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖和纖維連接蛋白等[6]。Rosenberg等[7]早期發現在大鼠腦內注射MMP-2可促使血腦屏障開放，因其可降解細胞外基質的主要成分如Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白和腦血管基底膜，導致血管源性腦水腫，故現將MMPs作為腦損傷嚴重程度的標志。通過應用MMPs抑制劑及類似物來抑制MMPs表達從而發揮對血腦屏障保護作用的研究已成為熱點。

本研究結果顯示HIBD后MMP-2在海馬區蛋白表達呈逐漸增高趨勢，從24 h開始與對照組比較差異有統計學意義，但在24 h至3 d期間增長趨勢緩慢，差異無統計學意義。3 d后顯著增高,到7 d時達高峰，與陳大慶等[8]研究基本一致。說明缺氧缺血刺激可誘導MMP-2表達增加，其可能參與HIBD后血腦屏障的破壞，但可能并非是導致HIBD后腦水腫的主要因子。一般認為，HIBD后血腦屏障的破壞及通透性增高造成的腦水腫于24～48 h達高峰。本實驗中HIBD后MMP-2表達高峰出現較晚，與腦水腫高峰時間不符。而近年多數研究提示，MMP-2與神經修復有著密切關系。Szepesi等[3]及Cossanzo等[4]研究表明，MMP-2可促進神經損傷后突觸的結構重建及再生。本實驗結果顯示HIBD后MMP-2表達于7 d時達高峰，與血管生成及神經膠質增生出現的時間基本平行，提示MMP-2在HIBD恢復階段可能發揮修復作用。馬躍文等[9]對大鼠進行跑臺訓練，發現7 d及14 d時缺血再灌注腦損傷組大鼠較假手術組Longa神經功能評分明顯降低，MMP-2及VEGF表達水平顯著升高，提示高表達的MMP-2和VEGF可能通過誘導血管發生而在神經保護中起著重要作用。Romanic 等[10]觀察到大鼠腦缺血后24 h MMP-2出現在梗死區巨噬細胞,其活性在第5天達到高峰，故認為MMP-2 可能有助于巨噬細胞向缺血區域的轉移，其主要功能為吞噬細胞碎片和壞死機體組織，有助于組織損傷的修復。

MMP-2 在HIBD發生發展過程中可能起著雙重作用，HIBD早期，MMP-2參與降解細胞外基質及基底膜，導致血腦屏障結構及功能受損；而在HIBD晚期，MMP-2可能促進突觸再生、新生血管生成，有利于神經修復。現在許多研究應用MMPs抑制劑，通過其抑制MMPs表達起到保護血腦屏障作用。但考慮到MMP-2的雙重作用，在MMPs抑制劑運用到臨床治療前還需進行更進一步研究，如其治療HIE最佳時間窗的選擇。同時鑒于MMP-2在HIBD晚期的保護作用，MMPs或類似物的應用可能為HIE的治療開辟新的道路，同樣其神經修復的具體機制仍需更深入的探索。

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Expression and significance of MMP-2 in the hippocampus of neonatal rats after hypoxia-ischemia brain damage

YinJie1,ChenRong2,XiaoDongfan1.

1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 2.DepartmentofNeonatal,People'sHospitalofGuizhouProvince,Guiyang550002,China.

Objective To explore the expression and significance of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in hypoxia-ischemia injury with infant rats. Methods 42 neonatal SD rats of 7 days old were randomly divided into sham operation group and hypoxia-ischemia brain damage model group, the latter group was further divided into six subgroups based on different time points following HIBD ( 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 3 d, 7 d) (n=6 in each group), the expression of MMP-2 was determined by immunohistochemical method. Results The expression of MMP-2 protein increased gradually after HIBD and showed a slow growth trend in 24 h group to 3 d group, and reached the peak at 7 d. Compared with the sham group, there was statistical significantly differences (P<0.05) in the MMP2 expression in 24 h,48 h, 3 d,7 d groups. Conclusion The expression of MMP-2 have changed differently at various level after HIBD which may be participated the development process of HIBD, and MMP-2 may also be involved in the repair of brain injury.

Matrix metalleproteinase-2； Hypoxia-ischemia brain damage； Neonatal rats； Hippocampus

貴州省科學技術基金資助項目[黔科合J字(2008)2308號]

R722.19

A

1002-6975(2016)04-0348-03

2015-09-21)

△通信作者，E-mail：chenr9999@yahoo.com.cn