人TIMP-2基因的克隆及其原核表達

徐國強 王偉 孫達權 黃小瓊 陳騰祥

(1. 貴州醫科大學生理學教研室； 2. 貴州醫科大學生物化學與分子生物學教研室，貴州 貴陽 550004)

人TIMP-2基因的克隆及其原核表達

徐國強1王偉1孫達權2黃小瓊1陳騰祥1

(1. 貴州醫科大學生理學教研室； 2. 貴州醫科大學生物化學與分子生物學教研室，貴州 貴陽 550004)

目的 構建人TIMP-2重組表達載體，并在大腸桿菌 BL21 (DE3) 中表達。方法 提取人肝癌細胞 (Hep G2)總RNA后， 經RT-PCR擴增獲得目的片段，插入克隆載體pMD18-T；酶切鑒定和測序后將TIMP-2導入原核表達載體pGEX-4T-1中，構建重組質粒pGEX-TIMP-2。將重組質粒轉化至大腸桿菌菌株BL21 (DE3)中，IPTG誘導融合蛋白表達后用SDS-PAGE電泳檢測并用western blot驗證(蛋白質印跡法)。結果 成功構建原核重組表達載體 pGEX-TIMP-2，并在原核宿主BL21中大量表達融合蛋白GST-TIMP-2。結論 克隆人TIMP-2基因并在原核生物中大量表達。

基質金屬蛋白酶抑制因子2； pGEX-4T-1； 原核表達； 肝癌

基質金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)是基質金屬蛋白酶(MMPs)的天然抑制劑[1]。兩者形成非共價復合物從而抑制MMPS的活性，減少細胞外基質的破壞，保持細胞間連接的完整性，降低腫瘤的轉移，改善預后[2]。細胞外基質(ECM)由基底膜和間質基質構成，基底膜是ECM的關鍵結構，它不僅為ECM提供物理支撐，同時還為細胞提供代謝支持[3]。ECM是腫瘤重要的微環境之一，能夠影響腫瘤細胞的生物學行為，包括調節細胞間的黏附以及腫瘤的發展和轉移[4]。Ⅳ型膠原是基底膜的主要組成成分，主要位于上皮和內皮細胞的基底層[5]，MMP-2是Ⅳ型膠原酶，能降解Ⅳ型膠原從而破壞ECM形成癌細胞侵襲和轉移的通道[6]。相比較TIMPs其他家族成員而言，TIMP-2在大多數正常成人組織間隙有大量表達，能特異性抑制MMP-2的活性從而減少ECM的降解，降低癌細胞的遷移能力[5,7]。

越來越多的臨床病理證據表明，腫瘤組織中TIMP-2的表達水平較低，這可能與腫瘤的侵襲性增加有關；相反，TIMP-2表達水平的增加，能抑制腫瘤的生長以及增強化療藥物的敏感性[7]。如在侵襲性胃癌以及腎透明細胞癌組織、食管癌、胃癌、非小細胞肺癌患者的血清中TIMP-2表達水平均較低[8-9]；腫瘤抑癌基因E-cadherin表達上調與TIMP-2的過度表達有關，有助于維持細胞間的黏附及抑制腫瘤的生長[1]。因此有研究表明TIMP-2與腫瘤的發展有極大關系。本研究擬構建TIMP-2的原核表達載體pGEX-TIMP-2并進行誘導表達，為后期獲取TIMP-2融合蛋白及探討肝細胞癌微環境與肝細胞癌發生發展的關系提供前期支持。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 高保真酶 Pyrobest DNA Polymerase；兔抗人多克隆抗體TIMP-2，購于Bioworld公司；限制性內切酶EcoR I、Xho I、T4 DNA Ligase、1kb DNA Ladder 和200bp DNA Ladder購自TaKaRa公司；Trizol、質粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒購自天根生物公司；瓊脂糖購自Sigma公司；SDS PAGE制膠試劑盒購自索萊寶生物公司；冰醋酸、濃鹽酸、異丙醇、氯仿等為分析純AR級；反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；引物合成及測序由北京Biomed公司完成。

1.1.2 菌株、質粒和培養基 用于分子克隆的宿主E. coli DH5α由本實驗室保存，用于表達的宿主 E. coli BL21(DE3)購自天根生物公司。克隆載體pMD18-T vector和原核表達載體pGEX-4T-1本實驗室保存。YT液體培養基(細菌培養用胰蛋白胨16 g/L，細菌培養用酵母提取物 10 g/L，氯化鈉5 g/L)；LB液體培養基(細菌培養用胰蛋白胨10 g/L，細菌培養用酵母浸粉 5 g/L，氯化鈉10 g/L， 固體培養基添加瓊脂粉15 g/L)用于大腸桿菌的培養。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲取 根據GenBank中人TIMP-2的基因序列(NM_003255)和pGEX-4T-1原核表達載體的多克隆位點設計合成一對引物。上游引物5’端加入EcoR I酶切位點，下游引物5’端加入Xho I酶切位點。引物序列見表1。

表1 TIMP-2上下游PCR引物

1.2.2 RT-PCR獲取目的片段與T載體的構建 提取人肝癌細胞(Hep G2)總RNA，經反轉錄的方法合成人源性cDNA第一鏈，以cDNA第一鏈為模板，以表1中核苷酸片段為引物，PCR擴增TIMP-2目的基因片段。瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，割膠回收目的片段，與pMD18-T 4 ℃過夜連接，產物轉化E. coli DH5α感受態細胞并接種于含氨芐青霉素(Amp 100 mg/mL)的LB平板，篩選出陽性菌落，LB液體培養基37 ℃振蕩培養10 h，抽提質粒后酶切(EcoR I、Xoh I)分析，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將該菌落送至北京Biomed公司進行測序，測序結果與GenBank中 (NM_003255) 人TIMP-2基因序列比對，并命名為pMD18-TIMP-2保存備用。

1.2.3 原核表達載體的構建 將測序正確的pMD18-TIMP-2質粒雙酶切，割膠回收TIMP-2基因片段與同樣雙酶切的原核表達載體pGEX-4T-1用T4連接酶4 ℃連接過夜。連接產物轉化E. coli DH5α感受態細胞，涂于含Amp的LB平板，37 ℃過夜培養后，挑取單菌落接種于含Amp的LB液體培養基，37 ℃培養10 h。抽提質粒后雙酶切分析，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對菌落進行序列測定，結果與GenBank數據(NM_003255) 人TIMP-2基因序列比對。將陽性克隆子命名為pGEX-TIMP-2。

1.2.4 GST-TIMP-2蛋白的誘導表達 將重組質粒pGEX-TIMP-2轉化BL21(DE3)感受態細胞，涂于含Amp的LB平板，37 ℃培養過夜，篩選出陽性菌落，接種于LB液體培養基，37 ℃、200r/min振搖培養過夜。按1∶500的比例取上述菌液接種于20 mL YT培養基中，37 ℃、200r/min振搖培養至OD600值達到0.6時，加入終濃度為0.2 mmol/L 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)， 24 ℃ 220 rpm/min誘導表達3 h，并取未加IPTG誘導的菌液3 mL留作對照。分別取各組菌液2 mL離心12 000r/min，5 min，收集菌體，PBS緩沖液重懸后加入 5×SDS上樣緩沖液加熱變性，12%的SDS-PAGE檢測融合蛋白。

1.2.5 Western Blot鑒定 取誘導及未誘導的菌液1 mL，離心后搜集菌體，分別向菌體沉淀中加入PBS、5×SDS上樣緩沖液振蕩混勻，加熱變性后12%的SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉至PVDF膜上，經Westrn blotting封閉液封閉后依次加入兔多克隆一抗、羊抗兔二抗，最后用ECL-Plus化學發光試劑顯色，于化學發光凝膠成像系統采集圖像保存。

2 結 果

2.1 人TIMP-2基因的獲取及重組載體pMD18-TIMP-2的構建與鑒定 (1)目的基因的獲取：提取人肝癌細胞(Hep G2)總RNA，經PCR擴增獲取TIMP-2基因片段，產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約663 bp處有明顯條帶(圖1)，與預期的TIMP-2基因片段大小一致。(2)T載體的構建：將pMD18-TIMP-2載體陽性菌落，質粒抽提后用EcoR I、Xoh I進行雙酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定為陽性克隆(圖2)。(3)測序鑒定：將瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的陽性菌落擴大培養12 h后，取1 mL送北京Biomed公司進行測序，經測序表明pMD18-TIMP-2中TIMP2的堿基序列與GenBank公布的(NM_003255)人TIMP-2基因序列一致，即TIMP-2基因成功克隆到pMD18-T載體。

2.2 人TIMP-2重組表達質粒pGEX-TIMP-2的構建 (1)人TIMP-2重組表達質粒的酶切鑒定：原核表達載體pGEX-TIMP-2的質粒酶切結果見圖3，結果中有兩條帶，在約4900 bp處的表達載體及663 bp處的目的蛋白，由此可初步鑒定人TIMP-2重組表達載體構建成功。(2)測序鑒定：將初步鑒定的陽性菌落擴大培養后，菌液送至北京Biomed公司進行測序鑒定，原核表達載體pGEX-TIMP-2中TIMP-2的基因序列與GenBank公布的(NM_003255)人TIMP-2基因序列一致，表明原核表達載體pGEX-TIMP-2構建成功。

注：A為瓊脂糖凝膠電泳檢測人總RNA；B為TIMP-2基因的PCR產物，M：200 bp ladder marker；1：人TIMP-2基因cDNA片段。圖1 RT-PCR擴增人TIMP-2 cDNA

注：M：200 bp ladder marker； 1：pMD18T空載體； 2和3：pMD18T-TIMP-2用EcoR I、Xho I雙酶切產物。圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質粒pMD18T-TIMP-2

注；M：1000 bp ladder marker；1和2：pGEX-TIMP-2用EcoR I、Xho I進行雙酶切產物。圖3 瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組原核表達質粒

2.3 融合蛋白TIMP-2的誘導表達與鑒定 (1)誘導表達：將誘導表達的pGEX-TIMP-2菌體沉淀經12%的SDS-PAGE鑒定，pGEX-TIMP-2菌液樣品在約48 kD處出現明顯的目的蛋白條帶，而未加IPTG誘導的菌體樣品在48 kD處無明顯條帶。結果表明TIMP-2蛋白被成功誘導表達，結果見圖4。(2)Western Blot鑒定GST-TIMP-2融合蛋白：一抗為TIMP-2多克隆抗體，二抗為羊抗兔IgG，進行Western Blotting免疫印跡分析，化學發光顯色后結果見圖5，GST-TIMP-2融合蛋白與兔多克隆抗體呈陽性反應，在約48 kD處有特異性蛋白反應條帶。

注：M：預染marker； 1、2、3均為在IPTG為0.2 mm/L時pGEX-TIMP-2菌株的表達產物；4、5、6均為未加IPTG誘導的pGEX-TIMP-2菌株。圖4 考馬斯亮藍R-250檢測融合蛋白TIMP-2

圖5 Western Blot鑒定GST-TIMP-2蛋白

3 討 論

不同的TIMPs對MMPs的親和力不同且每一種TIMPs都可以與幾種MMPs以非共價鍵形式生成1∶1的復合物，保持著相對的平衡狀態，對組織的修復、重塑、胚胎的插入、腫瘤細胞的浸潤及轉移中有重要的意義[10]。 MMPs可通過調節ECM的合成與分解，使膠原的合成與降解處于平衡狀態，當平衡遭到破壞，將導致ECM修復與重塑異常[11]。ECM的堆積容易造成組織纖維化，有研究[12-13]顯示在肝臟TIMP-2 能抑制 MMP2的活性，阻止ECM的降解，促進肝纖維化的發生，隨著肝纖維化的發展，MMPs的表達下降而TIMP-1和TIMP-2的表達升高，致使MMPs/TIMPs值降低，膠原降解減少，結果使總體ECM總量較正常肝臟增加3～8倍從而加劇了肝纖維化。肝動脈化療栓塞術(TACE)是目前肝癌治療中除手術切除外最常用的治療方法。有研究[14]顯示在肝動脈化療栓塞術術后，血清中MMP-2高表達水平和MMP-2 / TIMP-2的比值，能預測預后較差的TACE，由此表明MMP-2以及MMP-2/TIMP-2水平對肝癌預后有重要意義。

本研究通過提取肝癌細胞(Hep G2)總RNA，設計TIMP-2引物，擴增含CDS的共663 bp的基因片段，將該片段進行T-A克隆，經測序表明pMD18-TIMP-2中TIMP-2的基因序列與GenBank公布的(NM_003255)人TIMP-2基因序列一致。將測序正確的TIMP-2成功構建原核表達載體pGEX-TIMP-2，測序結果與上述一致。實驗中發現，pGEX-TIMP-2在IPTG濃度為0.2 mmol/L 24 ℃ 220 rpm/min誘導表達3 h，結果發現帶有GST標簽的目的蛋白在48 kD處得到大量表達。此外，由于表達載體上帶有GST標簽，有利于后期目的蛋白的純化。本研究中pGEX-TIMP-2原核表達載體的成功構建對后期系統性的研究TIMP-2基因和蛋白功能奠定基礎，并為后期探討TIMP-2對肝癌發生、發展的研究提供數據支持。

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Gene clone and expression of human tissue inhibitor of matrix metalloproteinases2 in Escherichia coli

XuGuoqiang1,WangWei1,SunDaquan2,HuangXiaoqiong1,ChenTengxiang1.

1.DepartmentofPhysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 2.DepartmentofBiochemicalandMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To construct the recombinant prokaryotic vector of human TIMP-2 (Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 2, TIMP-2), and then express it in E. coli BL21 (DE3). Methods Total RNA was extracted from human hepatoma cell line (Hep G2), and the TIMP-2 cDNA was obtained with RT-PCR. Then, the amplified TIMP-2 coding region by PCR technology was cloned into pMD18-T. After identification and sequence, the TIMP-2 DNA fragment was inserted into the prokaryotic expression vector of pGEX-4T-1, and the recombinant was transformed into E. coli BL21 (DE3) for expression. After induced by IPTG, the recombinant GST-TIMP-2 had been expressed and its molecular weight was approximately 48kD and identified by western blot. Results TIMP-2 gene coding region was cloned from Hep G2 cell and the recombinant plasmid of pGEX-TIMP-2 was successfully constructed and expressed fusion protein GST-TIMP-2 in BL21 induced by IPTG. Conclusion The pGEX-TIMP-2 recombinant vector was successfully constructed.

TIMP-2； pGEX-4T-1； Prokaryotic expression； Hepatocellular carcinoma

貴州省科學技術基金[黔科合LG字(2012)007]；貴州省科學技術基金[黔科合J字(2014)2025]

R329.2+5

A

1002-6975(2016)04-0344-04

2015-09-25)