華北地區(qū)圈養(yǎng)大熊貓糞便中產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌菌株的分離與鑒定

武紅敏，郭威,郭曉軍，周賢，朱寶成

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001)

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華北地區(qū)圈養(yǎng)大熊貓糞便中產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌菌株的分離與鑒定

武紅敏，郭威,郭曉軍，周賢，朱寶成

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001)

為分離篩選大熊貓腸道中具有纖維素降解能力的芽孢桿菌菌株，首先對(duì)8份大熊貓糞便進(jìn)行高溫水浴處理，利用剛果紅平板法進(jìn)行初篩和復(fù)篩，DNS法測(cè)定酶活力.結(jié)果分離出126株菌株，其中8株菌株纖維素降解能力較強(qiáng).結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定8個(gè)菌株均屬于芽孢桿菌屬，其中1株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，1株阿薩爾基芽孢桿菌(B.axarquienis)，2株西姆芽孢桿菌(B.siamensis)，4株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus).實(shí)驗(yàn)表明大熊貓腸道中存在多種降解纖維素的芽孢桿菌，其中新發(fā)現(xiàn)的有大熊貓?jiān)吹陌⑺_爾基芽孢桿菌和西姆芽孢桿菌，豐富了大熊貓腸道菌群的研究，并為高效生產(chǎn)纖維素酶提供新的菌種來源.探究了大熊貓消化道內(nèi)高效的纖維素降解菌，有利于實(shí)現(xiàn)高纖維類飼料資源化利用.

大熊貓；糞便；芽孢桿菌；纖維素酶

大熊貓是食肉目動(dòng)物中罕見的素食者，以采食箭竹為主.大熊貓除能消化吸收竹子中的大部分蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，也可以有效利用纖維素、半纖維素[1].但是在大熊貓基因組序列中并沒有發(fā)現(xiàn)編碼纖維素酶的相關(guān)基因[2]，因此，認(rèn)為大熊貓消化纖維素是依賴其腸道微生物的作用[3].譚志等[4]、魯海峰等[5]、馬清義等[6]分別研究了野外放歸和圈養(yǎng)大熊貓腸道菌群的種類、數(shù)量、分布及群落結(jié)構(gòu).馬海玲[7]從大熊貓糞便中分離得到13株纖維素分解菌，其中8株為真菌，5株為放線菌.王海娟等[3]研究推測(cè)了大熊貓腸道菌群消化竹纖維的過程.開展大熊貓腸道消化纖維素菌群組成和功能研究是十分必要的[8].

目前，對(duì)纖維素酶菌株已有深入研究，生產(chǎn)纖維素酶多使用真菌作為生產(chǎn)菌株；而以功能菌株來達(dá)到降解纖維素的目的時(shí)，則以細(xì)菌為優(yōu)，即由過去以真菌為生產(chǎn)菌轉(zhuǎn)到以細(xì)菌為生產(chǎn)主體[9].從菌劑的角度來講，芽孢桿菌穩(wěn)定性和環(huán)境適應(yīng)性好、產(chǎn)酶活性高，可以得到比較穩(wěn)定的菌劑，便于農(nóng)牧業(yè)上的應(yīng)用[10].目前所選育出來的芽孢桿菌菌株中高效產(chǎn)酶的菌種還不多，故仍然需要尋找新的產(chǎn)纖維素酶菌株或進(jìn)一步選育高產(chǎn)菌株[11].因此大熊貓腸道纖維分解菌的研究具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.

本實(shí)驗(yàn)擬從健康的大熊貓新鮮糞便中分離篩選纖維素降解芽孢桿菌菌株，并對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定，為纖維素降解提供新的菌種來源.

1 材料與方法

1.1 樣品及來源

大熊貓新鮮糞樣8份，于2014年10月份采自石家莊動(dòng)物園健康的大熊貓.

1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基、NB種子培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基[12]、菌種篩選培養(yǎng)基[13](CMC-Na培養(yǎng)基、剛果紅培養(yǎng)基)、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[14]、生理生化鑒定培養(yǎng)基(依據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法配制)，所有培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌15 min.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 纖維素降解菌的篩選

取樣：將新鮮的大熊貓糞便裝入無菌自封袋中，將裝有樣品的自封袋冷藏.

富集培養(yǎng)：將8份大熊貓糞便樣品混勻，取混合后的糞樣5 g于盛有50 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，搖床震蕩20 min，80 ℃水浴20 min滅活菌體.取水浴后的10 mL糞樣混懸液接種于100 mL富集培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min搖床富集培養(yǎng)24 h.

細(xì)菌菌株的分離：將富集培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行梯度稀釋，分別取稀釋度為10-4、10-5、10-6的菌液100 μL涂布于剛果紅平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h.挑取不同菌落形態(tài)的單個(gè)菌落，鏡檢，取G+菌株連續(xù)3次劃線接種NA平板，將單菌落接種于NA斜面，保存于4 ℃冰箱.

纖維素降解菌的初篩：將分離純化后的菌株點(diǎn)接到剛果紅培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h.觀察是否出現(xiàn)透明圈.

纖維素降解菌的復(fù)篩：將初篩得到的菌株接種于NB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)12 h，然后將種子液按6%的接種量接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h.將發(fā)酵液3 000 r/min離心10 min，取離心后的上清液60 μL注入CMC-Na平板孔內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)，24 h后滴加2 mg/mL剛果紅染色液，染色30 min后，再用蒸餾水和1 mol/L NaCl洗去染液，分別記錄透明圈直徑.

纖維素酶活力的測(cè)定：發(fā)酵上清液即為粗酶液，參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以及酶活力的測(cè)定.

酶活力定義：1 mL粗酶液每分鐘催化羧甲基纖維素鈉生成1 μmol 還原糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位U.

1.3.2 菌株鑒定

根據(jù)菌株的菌落和菌體形態(tài)特征、生理生化特性實(shí)驗(yàn)及16S rDNA序列分析進(jìn)行菌株的種屬鑒定，具體方法參照文獻(xiàn)[15]、文獻(xiàn)[17].

菌株形態(tài)鑒定：參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行.

菌株的生理生化鑒定：參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行.

16S rDNA序列分析鑒定：參考 Kim等[18]和Rainey等[19]的方法提取細(xì)菌總DNA，采用細(xì)菌 16S rDNA 的通用引物進(jìn)行PCR.產(chǎn)物純化后送北京寶銳通生物科技有限公司測(cè)序.將所測(cè)得的16S rDNA序列結(jié)果提交到GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似性較高的序列，利用Mega 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20].將8株菌株的16S rDNA基因提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù).

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

2.1.1 纖維素降解菌株的初篩

將富集樣品經(jīng)熱處理后，由剛果紅平板篩選得到126株具有降解纖維素能力的菌株.

2.1.2 纖維素降解菌株的復(fù)篩

對(duì)初篩得到的126株菌株進(jìn)行復(fù)篩，得到76株降解纖維素能力較高的菌株，部分菌株的透明圈大小見圖1、表1.

圖1 打孔法復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Results of stiletto method rescreening

菌株 透明圈直徑/mm菌株 透明圈直徑/mmN-218.43±0.12Y-119.53±0.06N-323.97±0.06Y-319.13±0.12N-524.03±0.15Y-620.40±0.10N-624.00±0.10Y-919.03±0.15N-723.53±0.15Y-1022.00±0.10N-1022.50±0.10Y-1118.00±0.00L-1121.47±0.062L-919.97±0.15L-1221.93±0.122L-1720.03±0.06

續(xù)表1

2.1.3 纖維素酶活力測(cè)定

對(duì)復(fù)篩過程中透明圈直徑>18.0 mm的40株菌株進(jìn)行酶活力測(cè)定，結(jié)果見表2.

表2 發(fā)酵液中纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果

由表2可以看出,2N-10、2N-12、2N-14、2L-9、2L-24、Y-6、Y-10和3X-10 8株菌株酶活性較高，因此，選取此8株菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究.

2.2 菌株的種屬鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株菌落形態(tài)如圖2所示，菌株菌體形態(tài)見圖3，芽孢形態(tài)見圖4，菌落形態(tài)特征見表3，菌體形態(tài)特征見表4.

圖2 菌株菌落形態(tài)Fig.2 Colonial morphology of strains

圖3 菌株菌體形態(tài)Fig.3 Mycelia morphology of strains

圖4 芽孢形態(tài)(2N-10)Fig.4 Spore of strain 2N-10

菌株菌落形狀菌落大小顏色邊緣光學(xué)特性表面隆起2N-10圓形適中乳白鋸齒狀不透明干燥四周隆起2N-12圓形適中乳白鋸齒狀不透明干燥四周隆起2N-14圓形適中白色鋸齒狀不透明干燥中間隆起2L-9圓形適中白色較規(guī)則不透明干燥四周隆起2L-24圓形偏大黃色褶皺 不透明干燥四周隆起Y-6圓形偏小乳白鋸齒狀不透明黏稠四周隆起Y-10圓形適中微黃鋸齒狀不透明黏稠中心凸起3X-10圓形適中乳白較整齊不透明濕潤(rùn)中心凸起

表4 菌株菌體形態(tài)特征

2.2.2 菌株的生理生化鑒定

生理生化結(jié)果見表5.菌株2N-12、Y-6和Y-10甲基紅實(shí)驗(yàn)為陽性，其余為陰性；糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，除2N-12和2N-14菌株外，其余都為陽性；丙二酸利用實(shí)驗(yàn)只有Y-6和Y-10菌株為陽性.其余各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果均一致.

表5 菌株的生理生化特征

續(xù)表5

“+”表示陽性，“-”表示陰性，以加號(hào)多少表示菌株活性的強(qiáng)弱.

2.2.3 菌株16S rDNA的分子鑒定結(jié)果

以菌株的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后在10 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果如圖5.由圖5可見，在約1 500 bp處有明亮的條帶，與預(yù)期大小一致.測(cè)序結(jié)果表明，8株菌株的16S rDNA序列長(zhǎng)度都在1 545～1 675 bp.

M.DNA Marker(bp)1-8.分別為2N-10、2N-12、2N-14、2L-9、2L-24、Y-6、Y-10和3X-10菌株的16S rDNA基因片段的PCR產(chǎn)物.圖5 16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)Fig.5 Electrophoresis detection of 16S rDNA PCR amplification

2.2.4 基于16S rDNA序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將測(cè)得菌株的序列提交到GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取較高相似度的標(biāo)準(zhǔn)菌株，利用Mega5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6—9.將8株菌株的16S rDNA基因提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，得到菌株序列號(hào)(KX214610～KX214617),見表6.

圖6 2N-12菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)Fig.6 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain 2N-12

圖7 2N-14菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)Fig.7 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain 2N-14

圖8 Y-10菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)Fig.8 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain Y-10

圖9 3X-10菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)Fig.9 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain 3X-10

菌株鑒定結(jié)果最大相似率/%登錄號(hào)Accessionnumbers2N-10甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus100 KX2146102N-12阿薩爾基亞芽孢桿菌Bacillusaxarquienis99.5KX2146122N-14枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis100 KX2146132L-9甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus100 KX2146152L-24甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus100 KX214611Y-6西姆芽孢桿菌Bacillussiamensis100 KX214616Y-10西姆芽孢桿菌Bacillussiamensis99.7KX2146143X-10甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus100 KX214617

經(jīng)16S rDNA分子鑒定，結(jié)合菌株的形態(tài)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參照文獻(xiàn)[15]和文獻(xiàn)[17]，發(fā)現(xiàn)菌株特征均與芽孢桿菌相近，2N-14為B.subtilis，2N-12為B.axarquienis，Y-6和Y-10為B.siamensis，2N-10、2L-9、2L-24和3X-10為B.methylotrophicus.

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大熊貓腸道菌群的研究主要集中在以大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、克雷伯氏桿菌(Klebsiella)、空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)為代表的致病菌；而對(duì)其腸道纖維素降解菌的研究較少.本實(shí)驗(yàn)從大熊貓的糞樣中共篩選到了具有較高纖維素酶活的菌株40株，為以后研究大熊貓腸道內(nèi)降解纖維素的機(jī)制提供了更多的菌源.在熊貓?bào)w內(nèi)篩選到產(chǎn)纖維素酶的菌種方面，榮華[21]從大熊貓腸道內(nèi)分離篩選出1株梭菌屬厭氧纖維降解菌PD-2，曹涵文等[22]于福州動(dòng)物園大熊貓糞便中分離出1株假單胞菌菌株NC020209，而本實(shí)驗(yàn)篩選到的纖維降解菌均為芽孢桿菌屬，較前2種菌生產(chǎn)更為容易、應(yīng)用更為廣泛.在熊貓?bào)w內(nèi)芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶酶活方面，樊程等[23]從雅安碧峰峽熊貓基地大熊貓糞便中分離得到1株好氧菌株解淀粉芽孢桿菌 NBRC15535，其纖維素總酶活最高僅為0.229 U/mL；周瀟瀟等[24]為進(jìn)一步弄清成年大熊貓腸道中芽孢桿菌的分布和尋求大熊貓微生態(tài)制劑的菌源，在大熊貓腸道中分離篩選出7株纖維降解菌，分別為4株枯草芽孢桿菌、1株蠟樣芽孢桿菌、2株短小芽孢桿菌，但并未進(jìn)行進(jìn)一步的酶活測(cè)定篩選；趙珊等[25]從四川臥龍自然保護(hù)區(qū)的新鮮大熊貓糞便內(nèi)篩選到1株好氧纖維素降解菌蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus，A1)，且在最適培養(yǎng)條件下纖維素酶活最高達(dá)到0.139 U/mL；而本實(shí)驗(yàn)篩選到的產(chǎn)纖維素酶菌株中，酶活在0.250 U/mL以上的有8株菌，分別為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)1株，阿薩爾基芽孢桿菌(B.axarquienis)1株，西姆芽孢桿菌(B.siamensis)2株，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)4株，高于上述報(bào)道.

本實(shí)驗(yàn)報(bào)道從大熊貓腸道中分離篩選得到具有纖維素降解能力的阿薩爾基芽孢桿菌、西姆芽孢桿菌，豐富了大熊貓腸道菌群的種類.目前對(duì)阿薩爾基芽孢桿菌和西姆芽孢桿菌的研究還很少.阿薩爾基芽孢桿菌方面，只有Ruiz-García 等[26]在2005年分離出了阿薩爾基芽孢桿菌的新種的報(bào)道，尚未有功能研究的報(bào)道，本研究首次報(bào)道了阿薩爾基芽孢桿菌具有降解纖維素的功能.西姆芽孢桿菌的研究主要集中在生物防治[27]和新型食品酶源[28]的報(bào)道，尚未發(fā)現(xiàn)西姆芽孢桿菌對(duì)于纖維素降解功能的研究.本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道阿薩爾基芽孢桿菌和西姆芽孢桿菌具有降解纖維素的功能，為進(jìn)一步開發(fā)2個(gè)菌株提供了理論基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Isolation and identification ofBacilluscapable of degrading cellulose from the feces captive giant panda of in north China

WU Hongmin,GUO Wei,GUO Xiaojun,ZHOU Xian,ZHU Baocheng

(College of Life Sciences,Agriculture University of Hebei,Baoding 071001,China)

This study aimed at screening strains ofBacillussp.capable of degrading cellulose and identifying the species of purpose strains.8 dung samples of giant panda were treated in water bath at high temperature.Congo red decolorizing ring method was used to screen the strains before DNS method to test the highest enzyme activity.The results showed that 8 strains of 126 strains isolated in dung of giant panda had highly efficient cellulose-degrading capability.Through morphological,physiological and biochemical analysis and the sequence analysis of 16S rDNA gene,8 strains were identified.The strains are allBacillussp.,including 1Bacillussubtilis(2N-14),1B.axarquienis(2N-12),2B.siamensis(Y-6、Y-10),and 4B.methylotrophicus(2N-10、2L-9、2L-24、3X-10).The test shows that there were many strains (Bacillussp.) capable of cellulose degradation in the dung of giant panda.The giant panda-derivedB.axarquienis,B.siamensiswere isolated and cultivated for the first time,which enriched the research of giant panda intestinal flora and provided new sources of strains for efficient production of cellulose.Exploring the efficiency of cellulose degradation bacteria in the digestive tract of panda is beneficial for the resource utilization of high fiber feed.

giant panda;feces;bacillus;cellulose

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.06.010

2015-12-22

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(12236606)；保定市科學(xué)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(15ZN017)

武紅敏(1990—)，女，河北藁城人，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生.E-mail:873659445@qq.com

朱寶成(1962—)，男，河北滄州人，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)牧微生物應(yīng)用技術(shù)研究.E-mail:zhu2222@126.com

S858.9

A

1000-1565(2016)06-0623-12