不同基源黨參種子冰凍切片技術(shù)探討

劉 玉，柴俊雯，陳紅剛，陸國弟，杜 弢*,2,3

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物遺傳育種研究所，甘肅 蘭州 730000）

不同基源黨參種子冰凍切片技術(shù)探討

劉 玉1，柴俊雯1，陳紅剛1，陸國弟1，杜 弢*1,2,3

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物遺傳育種研究所，甘肅 蘭州 730000）

以不同基源的黨參為試材進(jìn)行冰凍切片，種子經(jīng)過前處理、冷臺(tái)固定、冷凍切片、展片、染色、觀察并拍照等步驟，結(jié)果表明，當(dāng)冷臺(tái)溫度為-20℃、OCT包埋劑冷凍5～8 min、切片厚度為8～12 μm時(shí)，可以獲得較清晰的種子橫（縱）切面圖，切片組織完整性和圖片清晰度效果較好。

黨參；川黨參；素花黨參；種子；冰凍切片；技術(shù)

冰凍切片是一種在較低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然后進(jìn)行切片的一種方法，且不經(jīng)過脫水和透明、浸蠟等一系列的繁瑣前期實(shí)驗(yàn)步驟，組織形態(tài)不會(huì)收縮，具有簡便、快速、易操作、環(huán)境污染小等特點(diǎn)[1]。常用于組織化學(xué)、免疫定位及原位雜交等研究，在動(dòng)物和人體的研究、臨床手術(shù)中已被廣泛應(yīng)用[2]，近年來也逐漸應(yīng)用于藥材的根、莖、花、果實(shí)和種子研究[3～5]。

本試驗(yàn)以不同基源的黨參為主要試材，在最短時(shí)間內(nèi)制作出高質(zhì)量的切片，試圖建立一種適合于黨參種子快速、簡便、高效的冰凍切片技術(shù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

德國產(chǎn)Leica-CM 1950型恒冷切片機(jī)；日本產(chǎn)Feather一次性刀片；尼康80i顯微成像系統(tǒng)。

1.2 試劑

70%乙醇、1%番紅水溶液、0.1%固綠乙醇溶液（95%乙醇配制）、95%乙醇、OCT包埋劑、普通膠水、載玻片、蓋玻片、酒精燈、水合氯醛及50%甘油。

1.3 材料

黨參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）素花黨參（Codonopsis pilosula Nannf.Var.modesta（Nannf.）L. T.Shen）和川黨參（Codonopsis tangshen Oliv.）種子，均由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物遺傳育種研究所提供，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定。

2 方法與步驟

操作步驟：①前處理；②固定樣品至冷臺(tái)；③冰凍切片；④展片；⑤染色；⑥觀察并拍照。

2.1 前處理

樣品前處理比較了用水浸泡和不同濃度梯度的酒精浸泡對(duì)切片效果的影響，結(jié)果表明，兩種處理方法對(duì)種子切片基本沒有影響。考慮經(jīng)濟(jì)方面，將種子用清水洗滌3次后，置于室溫下在水中浸泡12～24 h。

2.2 固定樣品至冷臺(tái)

設(shè)定冷凍切片機(jī)溫度（-20℃），將試驗(yàn)用的毛筆、鑷子放入冷凍切片機(jī)內(nèi)一起降溫。待溫度降到-15℃以下時(shí)，用毛筆刷去除冷臺(tái)上的薄霜。將刀片固定在切片機(jī)的刀槽上，當(dāng)冷凍箱溫度降低至-20℃時(shí)，將種子放在托盤上，然后滴加OCT包埋劑或膠水，用大頭針使種子均勻地分散在包埋劑中。然后置于冷臺(tái)上，OCT冷凍5～8 min或膠水冷凍20～30 mim，使材料迅速冷凍并能夠牢固地黏附在托盤上。

2.3 切片

將托盤置于冷臺(tái)固定槽上，調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)切片厚度的旋鈕，搖動(dòng)旋轉(zhuǎn)手輪進(jìn)行切片。切片不可太厚，否則細(xì)胞容易重疊而影響觀察結(jié)果；也不可過薄，否則切片易碎、不完整。經(jīng)過多次試驗(yàn)，將種子切片厚度調(diào)為8～12 μm，在切片的過程中，切片刀上的霜層較厚，應(yīng)及時(shí)啟動(dòng)除霜程序去除霜層或者用毛筆刷刷掉，以防止卷片。

2.4 展片

用毛筆刷將切片移到載玻片上，或者直接將載玻片以合適的位置靠近刀片。由于溫差作用，切片自動(dòng)黏附在載玻片上。取出載玻片，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察等后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 染色

載玻片上的材料用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的番紅水溶液染色20 min，用蒸餾水洗滌3～5次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的固綠染色30 s，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇沖洗固綠至材料不褪色為止，之后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的甘油于材料表面，蓋上蓋玻片。

2.6 觀察并拍照

使用尼康80i顯微成像系統(tǒng)觀察切片并拍照。

3 結(jié)果

3.1 黨參種子微觀特征

黨參種子結(jié)構(gòu)由種皮、胚乳和胚3部分組成，種皮細(xì)胞排列整齊，其表面紋理呈條型網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)眼呈長條形或梭形。橫切面：種皮為一列棕紅色厚壁細(xì)胞，細(xì)胞呈柱狀，相鄰細(xì)胞間沒有間隙；胚乳細(xì)胞多層，呈多角形作徑向延長排列，內(nèi)含較多的糊粉粒；胚位于中央，外層細(xì)胞呈長方形或近方形環(huán)狀排列，靠近最里面呈徑向排列（如圖1中A黨參種子橫切顯微結(jié)構(gòu)）。縱切面：種皮細(xì)胞呈縱向長條形或梭形，細(xì)胞切向延長，壁孔紋增厚，胚乳多層，胚位于中央，呈長方形作徑向排列。

3.2 素花黨參種子微觀特征

與黨參種子結(jié)構(gòu)及其相似。橫切面：種皮表皮為一列棕紅色厚壁細(xì)胞，細(xì)胞柱狀；胚乳多層；胚位于中央。縱切面：種皮細(xì)胞呈縱向長條形或梭形；胚乳多層，呈多角形切向延長排列；胚位于中央，呈長方形作徑向排列，種皮細(xì)胞呈縱向長條形或梭形（如圖1中B素花黨參種子縱切顯微結(jié)構(gòu)）。

3.3 川黨參種子微觀特征

與黨參、素花黨參種子結(jié)構(gòu)及其相似，表面具有排列整齊的條型網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)眼呈梭形或長條形。橫切面：種皮為一列棕紅色厚壁細(xì)胞，細(xì)胞柱狀，外壁互相連接；胚乳多層，呈多角形作徑向延長排列，內(nèi)含較多的糊粉粒；胚位于中央，外層細(xì)胞呈近長方形或不規(guī)則方形環(huán)狀排列，靠近最里面呈徑向排列（如圖1中C川黨參種子橫切顯微結(jié)構(gòu)）。縱切面：種皮細(xì)胞呈縱向長條形或梭形；胚乳多層，呈多角形切向延長排列；胚位于中央，呈長方形作徑向排列。

圖1 不同基源黨參種子橫（縱）切面顯微結(jié)構(gòu)圖

4 結(jié)論與討論

4.1 不同冰凍切片條件的比較

新鮮材料直接包埋冷凍切片的關(guān)鍵是既有適合切片的冷凍溫度，又有最大程度減少冰晶形成的冷凍時(shí)間。為了得到適宜的冷凍溫度和冷凍時(shí)間，在冷臺(tái)溫度為-15℃、-20℃、-25℃的條件下，冷凍不同時(shí)間（20～40 min），觀察切片效果。通過反復(fù)比較發(fā)現(xiàn)，冷臺(tái)溫度-20℃、冷凍時(shí)間根據(jù)不同包埋劑冷凍時(shí)間不同、膠水作包埋劑一般冷凍25～30 min切片效果最好。若冷凍時(shí)間太短（20 min），因?yàn)榻M織本身較軟，會(huì)因包埋劑和材料的硬度不一致，在切片時(shí)易產(chǎn)生空洞，造成胚丟失，從而影響成片；若時(shí)間太長（40 min），則會(huì)導(dǎo)致冰晶太多，細(xì)胞破損，故20～30 mim較為適宜。OCT包埋劑一般冷凍約5～8 min，時(shí)間過長也不利于切片。

4.2 包埋劑對(duì)切片效果的影響

冰凍切片常用的包埋劑有水、普通膠水和OCT，比較分析了這3種包埋劑對(duì)冰凍切片的影響，結(jié)果表明，用水作包埋劑，較難切出完整的切片，種子都集中到底部，且無法進(jìn)行切片；OCT包埋劑與普通膠水效果基本相同，都能切出完整的切片，但用普通膠水必須用熱水沖洗后才能染上色，否則無法染色，但由于種子本身小，用水沖洗幾次就很難找到種子，且沖洗過程中種子容易碎；用OCT包埋后直接用水合氯醛透化染色再滴稀甘油蓋上蓋玻片后，就可以觀察清楚種子組織結(jié)構(gòu)。如果在冰凍前將材料浸沒在OCT中，讓OCT充分滲透進(jìn)組織中，切片效果更好。

4.3 切片厚度對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

經(jīng)過多次試驗(yàn)，種子切片厚度為8～15 μm時(shí)，切片效果良好，厚薄均勻、無皺折，鏡下組織結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞形態(tài)清晰、無明顯收縮、組織無人為裂隙、無空泡及空網(wǎng)狀形成、無冰晶等。主要觀察的組織結(jié)構(gòu)能較完整地呈現(xiàn)，與石蠟切片觀感相似，層次分明、分辨率良好。

綜上所述，冰凍切片是植物細(xì)胞和形態(tài)結(jié)構(gòu)研究的一種簡便、快捷、高效的方法。筆者以不同基源的黨參種子冰凍切片，取得了良好的效果。冰凍切片不易掌握，要做好一張冰凍切片不能只注重速度，其他步驟也很重要。

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1005-2690（2016）11-0112-02

：S567.5+3

：B

2016-06-24）

2012年中醫(yī)藥部門公共衛(wèi)生專項(xiàng)“2012年國家基本藥物所需中藥原料資源調(diào)查和監(jiān)測”（財(cái)社〔2012〕13號(hào)）課題“國家基本藥物所需中藥材種子種苗繁育基地建設(shè)”

劉玉（1991-），漢族，陜西榆林人，碩士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開發(fā)與質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)。

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：杜弢(1967-)，漢，碩士，教授，主要從事藥用植物育種、栽培的教學(xué)與研究。