大黃素可通過下調NF-κB的表達逆轉胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株的耐藥作用

張言濤 成伯寧 劉殿雷 黃 海 沈肖曹*

大黃素（Emodin，6-甲基-1，3，8-三羥基蒽醌）是從大黃屬、蓼屬、鼠李屬和番瀉葉中分離出來的主要有效單體，是一種酪氨酸激酶Ⅱ抑制劑；其具有抗微生物活性、抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、保護肝細胞等作用；據有關報道，大黃素作用于癌細胞中結構性地激活和放大的癌基因信號轉導通路，因此大黃素的細胞毒作用主要對癌細胞有效，正常細胞則不敏感，因此大黃素對正常細胞的毒副作用較小。最新報道顯示，低濃度大黃素可以增強卵巢癌細胞對紫杉醇化療的敏感性［1］。本課題組先前已發現大黃素顯著增強吉西他濱對胰腺癌的促凋亡作用［2］；但大黃素是否具有逆轉胰腺癌細胞對吉西他濱化療的耐藥作用尚不明確，因此本研究探討大黃素是否具有逆轉胰腺癌耐藥細胞株Bxpc-3/Gem的耐藥作用及其可能的逆轉機制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 大黃素（純度＞98%）、吉西他濱（美國禮來公司）；胎牛血清、含EDTA 胰酶、RPMI-1640培養基（美國Gibco 公司）；NF-κB抗體（美國Santa Cruz）。藥物配制：大黃素用DMSO配制成0.2mmol/L，-20℃冰箱保存，DMSO終濃度＜0.1%；吉西他濱用無菌生理鹽水配制成0.02mmol/L。

1.2 細胞培養 人胰腺癌細胞株Bxpc-3購自ATCC，培養于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養；Bxpc-3/GEM是采用濃度梯度倍增法誘導建立耐藥細胞株Bxpc-3/Gem。

1.3 不同濃度大黃素對Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細胞增殖的抑制作用 收集處于對數生長期的Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細胞，用完全培養基配制成單細胞懸液，以每孔4×103的細胞數接種至96孔板，放入CO2培養箱37℃培養過夜后，分別給予不同濃度的大黃素（10、20、40、80、160μm）處理，并設正、負對照組。藥物處理48h后，棄上清液，每孔各加入180μl培養液和20μl MTT（5mg/ml）溶液，繼續培養4h，小心吸棄培養液，每孔加入DMSO150μl，振蕩器震蕩10min，選擇波長490nm用全自動酶聯免疫檢測儀測定每孔吸光度（A）。每組設6個復孔，實驗重復3次。計算細胞存活率。細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.4 大黃素聯合吉西他濱對Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細胞增殖的影響 Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細胞以每孔4×103的細胞數接種至96孔板，過夜后，大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨及聯合處理48h，棄上清液，加入MTT（5mg/ml）溶液，繼續培養4h，吸棄培養液，加入DMSO150μl，震蕩10min，測定每孔吸光度（A）。每組設6個復孔，實驗重復3次。計算細胞存活率。

1.5 RT-PCR法檢測大黃素及吉西他濱處理后Bxpc-3/Gem細胞中NF-κB基因的表達 大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨及聯合處理Bxpc-3/Gem細胞48h后，用trizol裂解細胞，提取總RNA，紫外分光光度計260nm波長測定RNA濃度；cDNA合成按照標準方案（Fermentas cDNA第一鏈合成試劑盒說明書）進行，PCR反應（TIANGEN2×Taq PCR MasterMix說明書）NK-KB引物 上 游 ：5'-AGCACAGATACCACCAAGACCC-3'， 下游：5'-CCCACGCTGCTCTTCTATAGGAAC-3'，目的產物長度300 bp；PCR擴增條件為：NF-κB：94℃30s，54℃30s，72℃20s，30個循環。GAPDH作內參照；PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 EMSA 實驗檢測大黃素及吉西他濱處理后Bxpc-3/Gem細胞中NF-κB基因的活性 大黃素與吉西他濱單獨及聯合處理Bxpc-3/Gem細胞48h后，提取核蛋白（按照PIERCE的核蛋白抽提試劑盒說明書的步驟）。NF-κB探針序列：5'- AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3'；5'- GCC TGG GAA AGT CCC CTC AAC T-3'，3'端標記生物素；配置6.5% 非變性聚丙烯酰胺凝膠；恒壓預電泳60min，電壓120 V；取核蛋白10μg加入已計量的超純水，室溫反應20min，加入生物素標記探針后室溫再反應20min；恒壓電泳100min，電壓120 V，電泳結束后印跡轉移，用帶正電荷尼龍膜380mA 恒流電轉40min，轉移完后將尼龍膜置于波長254nm紫外燈下交聯10min；封閉液20ml室溫封閉20min，將膜再用抗生物素蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶結合物/封閉液（1∶300稀釋液）20ml于室溫孵育30min，1×洗滌液洗膜，5min/次，共20min，最后將膜放入平衡液20ml中平衡10min，化學發光數字成像。

1.7 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以（s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃素對Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細胞增殖的抑制作用 不同濃度的大黃素（10、20、40、80、160μm）作用Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細胞48h，MTT檢測細胞增殖。大黃素對耐藥細胞株Bxpc-3/Gem具有明顯的增殖抑制作用，并且具有濃度依賴性。與親本株Bxpc-3比較，大黃素對耐藥株Bxpc-3/Gem的增殖抑制作用并未減弱。

不同濃度的大黃素（10、20、40、80、160μm）作用Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細胞48h，MTT檢測細胞增殖；設正、負對照組，正對照組（空白對照組）為加入等量生理鹽水，負對照組為加入等量DMSO。Bxpc-3/Gem細胞各組細胞增殖率分別為：對照組（98.23±2.76）%；10μm組（92.56±2.85）%；20μm 組（84.72±3.07）%；40μm 組（68.83±2.27）%；80μm 組（59.20±2.94）%；160μm 組（46.74±1.64）%；Bxpc-3細胞各組細胞增殖率分別為：對照組（96.53±2.96）%；10μm 組（90.44±1.52）%；20μm 組（85.37±2.62）%；40μm 組（66.36±1.81）%；80μm 組（58.54±2.28）%；160μm 組（48.46±2.55）%。

2.2 大黃素可顯著提高耐藥細胞株Bxpc-3/Gem對吉西他濱的增殖抑制作用 大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨及聯合處理Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細胞48h；MTT檢測細胞增殖，吉西他濱單獨作用時，對Bxpc-3/Gem與Bxpc-3細胞的抑制率分別為11.24%與34.53%（P＜0.01）；吉西他濱聯合大黃素時，對兩種細胞的抑制率分別是50.74%與54.72%（P＞0.05）。由此推測大黃素能夠提高胰腺癌耐藥細胞株Bxpc-3/Gem對吉西他濱的敏感性。

大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨及聯合處理Bxpc-3/Gem與Bxpc-3細胞48h。MTT檢測細胞凋亡。Bxpc-3/Gem細胞各組細胞增殖率分別為：對照組（99.25±3.15）%；大黃素組（70.76±2.43）%；吉西他濱組（88.76±2.72）%；聯合組（49.26±1.77）%；Bxpc-3細胞各組細胞增殖率分別為：對照組（97.64±3.15）%；大黃素組（68.76±2.96）%；吉西他濱組（65.47±1.85）%；聯合組（45.28±2.53）%。

2.3 大黃素對Bxpc-3/Gem細胞中NF-κB mRNA基因的影響 大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨及聯合處理Bxpc-3/Gem細胞48h，采用RT-PCR法檢測基因的表達。大黃素單藥不僅可下調Bxpc-3/Gem細胞中NF-κB的基因表達，而且大黃素與吉西他濱聯合處理Bxpc-3/Gem細胞具有明顯的協調作用（P＜0.05）。

2.4 DNA-binding activity of NF-kB by EMSA 大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨及聯合處理Bxpc-3/Gem細胞48h，提取核蛋白后，EMSA實驗檢測NF-kB的活性表達；與對照組比較，大黃素顯著降低NF-kB活性的表達，吉西他濱增加NF-kB活性的表達，大黃素聯合吉西他濱也明顯降低NF-kB活性的表達（P＜0.05）。

3 討論

胰腺癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤。外科手術是目前治療胰腺癌最好的手段，但由于早期診斷困難，90%的患者確診時已是晚期，手術切除率較低，且易復發。化療是治療胰腺癌尤其是晚期胰腺癌的重要手段，吉西他濱是晚期胰腺癌化療的首選藥物，但在臨床應用中療效有限，根治術后輔助用藥的中位生存時間僅為22.1個月；且近些年臨床研究顯示吉西他濱僅對12%的進展期胰腺癌患者有效［3］。聯合治療在一定程度上改善了晚期胰腺癌的療效，但仍不夠理想，晚期胰腺癌患者的中位生存時間仍僅有6.5～9.4個月［4］，其主要原因是化療耐藥性的產生，吉西他濱可使多數胰腺癌逐步耐藥。

大黃素作為天然的化療輔助藥物，其能抑制多種惡性腫瘤細胞生長，也可以協同增強紫杉醇、吉西他濱等化療藥物的抗腫瘤作用；據有關報道，大黃素可以增強Her-2/neu過表達肺癌細胞對順鉑、阿霉素以及依托泊苷的敏感性［5］；還可以增強人食管癌細胞EC/CUHK1、人髓樣白血病細胞NB4、U937對三氧化二砷的敏感性［6］。但大黃素是否有逆轉胰腺癌細胞對化療藥物耐藥作用的相關報道較少。本研究首先通過采用濃度梯度倍增法誘導建立耐藥細胞株Bxpc-3/Gem。MTT法檢測結果顯示：不同濃度的大黃素對Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細胞進行處理，結果表明大黃素對耐藥細胞株Bxpc-3/Gem同樣有抑制細胞增殖的作用，且具有濃度依賴性，與敏感株比較無明顯差異；大黃素（40μm）聯合吉西他濱處理Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細胞，可以顯著增強耐藥細胞株對吉西他濱的敏感性，提高吉西他濱對Bxpc-3/Gem的增殖抑制作用。在此基礎上，本課題進一步探討了大黃素逆轉胰腺癌耐藥細胞株Bxpc-3/Gem耐藥的可能分子機制。

NF-κB是一種普遍存在的核轉錄因子，與機體免疫、炎癥反應、細胞增殖、腫瘤轉移等有關。近些年報道，NF-κB與腫瘤化療耐藥的產生關系密切［7］。另有報道，可通過下調NF-κB的表達量和抑制其轉錄活性來抑制MDR1基因的表達，最終使P-gp的表達量和功能下降，從而達到逆轉乳腺癌細胞系MCF-7的化療耐藥［8］。NF-κB除了可通過MDR1參與耐藥的產生與進展外，還可以通過其它途徑參與［9］。因此，NF-κB在腫瘤化療耐藥的形成中起著重要的作用，其可以通過多種機制參與腫瘤化療耐藥的形成。本研究運用RT-PCR方法從基因水平檢測NF-κB，并用EMSA實驗檢測NF-κB的活性，發現大黃素組及聯合吉西他濱組NF-κB的表達及活性明顯降低。由此推測大黃素可通過下調NF-κB的表達及抑制其活性，參與逆轉胰腺癌耐藥細胞株對吉西他濱的耐藥作用。

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