無菌性腦膜炎主要病原Echovirus 30快速檢測(cè)系統(tǒng)的建立

閆強(qiáng)

【摘要】目的：建立一套造成無菌性腦膜炎的主要病原Echovirus 30的快速檢測(cè)系統(tǒng)，增加I臨床病例的快速篩查和檢測(cè)。方法：通過對(duì)Echovirus 30病毒基因組的核酸序列比對(duì)，設(shè)計(jì)出針對(duì)Echovirus 30的特異性檢測(cè)引物，并對(duì)2011年5月-8月間在中國(guó)南方地區(qū)的一次無菌性腦膜炎爆發(fā)流行進(jìn)行報(bào)道和病原檢測(cè)。結(jié)果：在188例無菌性腦膜炎臨床病例中，98.9%為<1 5歲的兒童。所有標(biāo)本使用腸道病毒通用引物檢測(cè)陽性的為109例，其中使用E30特異性VP1段引物檢測(cè)陽性的7 9例，對(duì)79株E30的VP1段測(cè)序分型顯示，引起本次爆發(fā)流行的E 30由Ⅶ型造成，而與Ⅰ-Ⅵ型的同源性為69.8%-87%。結(jié)論：本研究成功建立了一套快速、簡(jiǎn)便、特異的Echovirus 30檢測(cè)系統(tǒng)，并依據(jù)該系統(tǒng)第一次報(bào)道了在中國(guó)南方地區(qū)引起無菌性腦膜炎爆發(fā)的腸道病毒病原。

【關(guān)鍵詞】無菌性腦膜炎；主要病原；臨床

無菌性腦膜炎中有35-83%由腸道病毒引起，其中Echovinm占到80-90%，Echovirus 30（E30）是其最主要的病原體，E30可通過糞-口途徑傳播，感染后通常臨床癥狀不明顯，但也有部分病例可引起急性發(fā)熱或神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥如腦炎、腦膜炎、胸膜炎、心肌炎、結(jié)膜炎等。由E30造成的無菌性腦膜炎在世界范圍內(nèi)廣泛流行，尤其是最近10年來其爆發(fā)流行有逐漸增多的趨勢(shì)。

1材料和方法

1.1標(biāo)本的收集

214份臨床咽拭子標(biāo)本采自2011年5月22日至8月6日間有無菌性腦膜炎臨床癥狀的病例，咽拭子在標(biāo)本保存液中充分?jǐn)噭?dòng)以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞后立即提取病毒RNA或放入-20℃保存。

1.2RNA的提取

從200～1咽拭子中進(jìn)行病毒RNA的提取，使用磁珠法進(jìn)行（GenMag Biotechnology，beijing，China），嚴(yán)格按照說明書操作，最終使用50μl的DEPC處理的水進(jìn)行洗脫。提取的病毒RNA直接進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)或存放于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3序列分析

測(cè)得的序列使用SeqMan軟件（Lasergene package，DNASTAR Inc，Madison，WI，USA）進(jìn)行拼接。序列比對(duì)采用ClustalW方法（MEGA4.0，www.megasoftware.net），基因進(jìn)化樹構(gòu)建采用neighbor-joining方法（MEGA4.0，www.megasoftware.net）。

2結(jié)果

所有188例臨床病例中有98.9%的病例年齡小于15歲，男女比為23：1（131：57），在年齡分布上本次無菌性腦膜炎爆發(fā)中的病例主要集中于3-7歲（88例，46.8%）及10-15歲（48例，25.5%），該年齡分布特點(diǎn)與已報(bào)道的手足口病的年齡分布有所不同，手足口病病例主要集中于1-5歲的兒童。在無菌性腦膜炎爆發(fā)期間6、7月是其主要流行期，占到所有病例數(shù)的85.1%。對(duì)本次無菌性腦膜炎暴發(fā)流行中的188例臨床病例標(biāo)本進(jìn)行5UTR區(qū)的腸道病毒通用診斷引物的檢測(cè)，共有109例診斷為腸道病毒感染（60%）。其中79例經(jīng)過E30 VP1特異性檢測(cè)引物診斷為陽性。

在GenBank上下載76株之前報(bào)道的E30各型及亞型的分離株VP1序列作為參考株與本次無菌性腦膜炎爆發(fā)收集的79株E30-VP1序列進(jìn)行同源性比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹，以核苷酸序列存在12%差異作為基因型的分型標(biāo)準(zhǔn)，所有序列可分為7個(gè)基因型（Ⅰ-Ⅶ），各基因型型間核苷酸同源性在63.9%-87.2%之間，型間氨基酸同源性在91.8%-98.6%之間，型內(nèi)核苷酸同源性在93.7%-97.9%，型內(nèi)氨基酸同源性在98.4%-99.7%之間，在本研究中分離到的79株E30均為Ⅶ型。

3討論

E30是造成無菌性腦膜炎爆發(fā)流行的主要腸道病毒，其流行特點(diǎn)、基因多樣性在歐美和亞太地區(qū)有一定報(bào)道，但在中國(guó)大陸地區(qū)對(duì)其流行情況的報(bào)道則相對(duì)較少，其原因主要是還缺乏快速、特異的診斷方法，同時(shí)對(duì)中國(guó)南方地區(qū)造成無菌性腦膜炎的E30流行情況也從未進(jìn)行過相關(guān)研究。在2011年春夏季節(jié)，在中國(guó)南方的廈門市及周邊地區(qū)出現(xiàn)了一次無菌性腦膜炎的爆發(fā)流行，我們通過建立一套針對(duì)性較強(qiáng)的快速診斷系統(tǒng)，并對(duì)臨床標(biāo)本直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增從而證明該系統(tǒng)具有較好的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，從而確定此次爆發(fā)中E30均為同一基因型，提示較好的監(jiān)控手段將有利于新的暴發(fā)流行的控制和預(yù)防。