雌激素受體對乳腺癌細胞截短型神經激肽受體-1的調控作用

劉曉彬，仝穎娜，張露芳，周云麗

雌激素受體對乳腺癌細胞截短型神經激肽受體-1的調控作用

劉曉彬，仝穎娜，張露芳，周云麗△

目的 探討雌激素受體α（ERα）陽性的乳腺癌細胞中ERα對神經激肽受體-1截短型變異體（NK1R-Tr）的調控作用，以及ERα是否通過調控NK1R-Tr的表達，間接調控細胞的增殖能力。方法染色質免疫共沉淀（CHIP）實驗驗證ERα是否可以結合到NK1R-Tr啟動子上游的ERα反應元件，直接調控NK1R-Tr的表達；熒光素酶報告基因實驗驗證ERα是否對NK1R-Tr的表達起正性調控作用。Western blot實驗和RT-PCR實驗檢測乳腺癌細胞系MCF-7和T47D的ERα和NK1R-Tr在蛋白水平和mRNA水平的表達情況；以及在ERα激動劑雌二醇（E2）刺激的條件下，小干擾RNA敲除ERα后，NK1R-Tr在不同水平的表達情況；小干擾RNA敲除NK1R-Tr后，CCK-8和克隆形成實驗檢測敲除NK1R-Tr的乳腺癌細胞的增殖能力。結果在NK1R-Tr基因啟動子上游存在ERα的反應元件，ERα在E2存在條件下作用于該反應元件，對NK1R-Tr的表達起正性調控作用。同樣在E2刺激的條件下，敲除乳腺癌細胞MCF-7內源性ERα后，NK1R-Tr在蛋白水平和mRNA水平的表達均下降；且敲除NK1R-Tr的MCF-7細胞增殖能力較未敲除組明顯降低。結論在ERα陽性的乳腺癌細胞中，ERα正性調控NK1R-Tr的表達，從而增強細胞的增殖能力。

乳腺腫瘤；細胞系，腫瘤；雌激素受體α；受體，神經激肽1；RNA，小分子干擾；染色質免疫沉淀法；細胞增殖；熒光素酶報告基因

乳腺癌（breast cancer,BC）作為全球女性最常見的惡性腫瘤，正日益受到全社會的關注，其致死率在各種女性腫瘤中位列第二［1］。Ho等［2］研究顯示大約70%的乳腺癌患者存在雌激素受體α（ERα）過表達，且對內分泌治療敏感［3］。在分子水平上，ERα作為轉錄因子，在其配體17β-雌二醇（E2）存在的條件下，可以調控靶基因的表達，參與到包括乳腺癌在內的多種生理和病理活動中［4］。前期研究表明，神經激肽受體-1（NK1R）主要有2個亞型：全長型亞型NK1R-FL和截短型亞型NK1R-Tr，并且NK1R-Tr的表達量隨腫瘤惡性程度的增高而增高［5-7］，促進了乳腺癌細胞的遠處轉移［8］。盡管有大量關于ERα所參與的病理生理過程的報道［9］，但ERα與NK1RTr之間的調控機制卻鮮有研究。在乳腺癌細胞中，ERα是否能通過基因和非基因組途徑與NK1R-Tr相互作用，從而調控乳腺癌細胞的增殖能力尚不明確，本研究將對這一問題進行分析，旨在為乳腺癌的治療與判斷預后提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系與主要試劑乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和T47D與人腎臟HEK-293工具細胞均購自美國典型菌種保藏中心（ATCC）。β-actin、ERα與NK1R-Tr PCR引物，NK1R-Tr和ERα的小干擾RNA（siRNA-NK1R-Tr，siRNA-ERα）均購自廣州銳博生物科技有限公司。鼠源βactin單克隆抗體購自美國Sigma-Aldrich公司；兔源ERα單克隆抗體購自美國CST公司；羊抗鼠和羊抗兔HRP標記的IgG購自英國的Upstate公司；反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購自美國Thermo公司。染色質免疫共沉淀（CHIP）試劑盒購自美國CST公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學試劑公司。轉染試劑Lipofectamine2000（lipo2000）購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 ERα陽性的乳腺癌細胞系的選擇和蛋白免疫印跡（Western blot）實驗采用常規提取細胞總蛋白方法提取乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7和T47D細胞總蛋白，MDAMB-231細胞蛋白作為ERα的陰性對照蛋白，MCF-7和T47D細胞蛋白為ERα陽性待檢測蛋白。以同樣的方法提取野生型和干擾型（敲除NK1R-Tr和ERα）乳腺癌細胞MCF-7和T47D總蛋白，在4%SDS-PAGE濃縮凝膠和10% SDS-PAGE分離凝膠電泳分離；電泳結束后切去濃縮膠部分，250 mA、90 min電轉移蛋白至PVDF膜，牛奶常溫封閉1 h；TBST輕輕沖洗，裁剪ERα、NK1R-Tr和β-actin目的條帶分別置于ERα特異性一抗（1∶2 000），NK1R的N末端特異性一抗（1∶100）和β-actin特異性一抗（1∶5 000）中孵育，4℃過夜。二抗1∶8 000稀釋，將PVDF膜置于二抗孵育液中室溫振搖孵育1 h，用ECL發光劑顯示陽性條帶。

1.2.2 CHIP培養乳腺癌MCF-7細胞，在培養上清液中加入ERα激動劑E2，待細胞生長覆蓋率為80%～90%時，收集細胞，冰PBS洗3次，用1%甲醛交聯10 min，加甘氨酸中和甲醛，棄廢液，冰PBS重復洗3次。加入Micrococcal Nuclease 37℃孵育20 min，加0.5 mol/L EDTA終止消化。超聲波細胞粉碎機（ScientzⅡD）20%輸出功率，超聲破碎細胞后離心，取上清并分為實驗組與陰性對照組。實驗組加入Anti-ERα抗體，陰性對照組加入非特異性IgG，均4℃孵育過夜，待抗體與ERα-DNA復合物相互結合后，加入Protein G磁珠，沉淀抗體-ERα-DNA復合物，并對沉淀下來的復合物進行清洗。洗脫，得到可能富集ERα-DNA的復合物，解交聯，用DNA純化柱純化并富集被沉淀下來的DNA片段，對包括NK1R 5′側旁區ERα的反應元件在內的NK1R-Tr的DNA進行實時定量（RT）-PCR分析。

1.2.3 熒光素酶報告基因實驗培養乳腺癌MCF-7細胞，提取細胞總RNA后，反轉錄為cDNA，擴增可能含有ERα的反應元件在內的NK1R-Tr的DNA啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒中，形成pMIR-luciferase-NK1R-Tr-WT質粒；并用突變試劑盒構建pMIR-luciferase-NK1R-Tr-MUT質粒。將表達ERα的質粒ERα-plasmid與pMIR-luciferase-NK1R-Tr-WT質粒共轉染入HEK-293細胞作為實驗組，將不表達ERα的陰性對照質粒ERα-HK與pMIR-luciferase-NK1R-Tr-WT質粒共轉染入HEK-293細胞作為陰性對照組，加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，檢測熒光強度，將實驗組的結果與對照組進行比較。

1.2.4 小干擾RNA的轉染培養乳腺癌細胞MCF-7和T47D，對數生長期時將細胞接種于6 cm培養皿中，饑餓過夜。將10 μL lipo2000和10 μL溶好的siRNA分別加入400 μL無血清培養液中，各自孵育10 min后混合孵育20 min，緩慢滴加于培養皿中，邊滴加邊混勻。于轉染后6 h換含10%胎牛血清的培養液，并觀察細胞生長狀態。敲除ERα的siRNA和敲除NK1R-Tr的siRNA分別有3個序列，只選取2個最有效的序列進行實驗，敲除ERα的siRNA標記為siRNA-#1、siRNA-#2，敲除NK1R-Tr的siRNA標記為siRNA-*1、siRNA-*2。

1.2.5 RT-PCRTrizol處理對數生長期的乳腺癌細胞，提取野生型和干擾型（敲除ERα）MCF-7細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，采用特異性引物進行RT-PCR。NK1R-Tr引物上游5′-GACCATCTACATACACAGTGGC-3′，下游5′-GGCT?GAGTTGTGTGATGATAAG-3′，ERα引物上游5′-TCCAG?CACCCTGAAGTCTCT-3′，下游5′-AGATGCTCCATGCCTTT?GTT-3′，內參照β-actin引物上游為5′-TTGCCGACAGGAT?GCAGAAGGA-3′，下游為5′-AGGTGGACAGCGAGGCCAG?GAT-3′。每次實驗重復3次。NK1R-Tr的相對表達量（RQ）=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對照=（Ct樣品NK1R-Tr-Ct樣品β-actin）-（Ct對照NK1R-Tr-Ct對照βactin）。

1.2.6 CCK-8比色法檢測細胞的增殖能力培養siRNA-*1敲除NK1R-Tr的MCF-7細胞和T47D細胞，對數生長期時進行消化計數，接種于96孔板，接種密度為2 000個/孔。于貼壁后每孔加8%的CCK-8溶液，37℃孵育3 h后測0 day的光密度（OD）值，以同樣的方法檢測1、2、3、4、5 d的OD值。每天每個細胞做8個復孔，取其OD值的平均值，每個實驗重復3次。

1.2.7 克隆形成實驗培養siRNA-*1敲除NK1R-Tr的MCF-7細胞和T47D細胞，對數生長期時進行消化計數后接種于6 cm培養皿中，搖勻。接種密度為500個/培養皿，37℃、5%CO2環境培養7～14 d。甲醇固定10 min，0.005%的結晶紫染色20 min。以大于50個細胞作為1個克隆，顯微鏡下計數。每種處理的細胞做3個重復。

1.3 統計學方法采用SPSS 19.0軟件處理，計量資料進行正態性檢驗以及方差齊性檢驗，以表示，兩個樣本均數的組間比較采用獨立樣本的t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Western blot結果驗證乳腺癌細胞系ERα的表達情況在內參β-actin表達量一致的條件下，MDA-MB-231細胞的ERα表達為陰性，MCF-7和T47D細胞的ERα的表達為陽性，且MCF-7的表達量較T47D細胞高，見圖1。

Fig.1 ERα expression in breast cancer cells detected by Western blot assay圖1 ERα在乳腺癌細胞系表達的Western blot檢測

2.2 CHIP與熒光素酶報告基因實驗證明ERα對NK1R-Tr的正調控作用在ERα陽性的乳腺癌細胞MCF-7中進行實驗。CHIP結果顯示在E2刺激的條件下，Anti-ERα組的NK1R-Tr表達量較IgG陰性對照組明顯升高（t=6.495，P＜0.01），見圖2。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，在共轉染了NK1R-Tr-WT報告基因質粒與表達ERα質粒ERα-piasmid的HEK-293細胞中，熒光素酶活性較轉染NK1R-Tr-WT報告基因和ERα-HK的對照組明顯升高（t=3.289，P＜0.05）；而轉染了NK1R-Tr-MUT和ERα-plasmid組，轉染了NK1R-Tr-MUT和ERα-HK組的熒光素酶活性均較轉染NK1R-Tr-MUT和ERα-HK的對照組沒有明顯差異，見圖3。

2.3 敲除MCF-7細胞內源性ERα，NK1R-Tr表達明顯下降siRNA轉染敲除乳腺癌細胞MCF-7和T47D的內源性ERα后，在E2刺激的條件下Western blot結果顯示，轉染siRNA-#1和siRNA-#2的細胞中，ERα的蛋白表達量較轉染對照序列的細胞明顯下降，并且NK1R-Tr的蛋白表達量較轉染對照序列的細胞也有明顯的下降趨勢，見圖4。RTPCR檢測敲除ERα的MCF-7細胞中內源性ERα和NK1R-Tr的mRNA表達水平，結果顯示，同樣在E2刺激的條件下，轉染siRNA-ERα組細胞中的ERα和NK1R-Tr的表達在mRNA水平較轉染對照序列的細胞均明顯降低，差異有統計學意義（tERα= 5.549，tNK1R-Tr=4.933，均P＜0.01），見圖5。

Fig.2 CHIP assay in MCF-7 cells圖2 乳腺癌細胞系MCF-7細胞中染色質免疫共沉淀產物的RT-PCR檢測（＊＊P＜0.01）

Fig.3 Luciferase reporter gene assay of ERα and NK1R-Tr圖3 ERα與NK1R-Tr熒光素酶報告基因實驗（＊P＜0.05）

Fig.4 The expression of NK1R-Tr detected by Western blot assay圖4 敲除ERα的乳腺癌細胞NK1R-Tr表達的Western blot檢測

2.4 敲除乳腺癌細胞NK1R-Tr的表達，其增殖能力下降siRNA轉染敲除乳腺癌細胞MCF-7和T47D的內源性NK1R-Tr，Western blot結果顯示，在轉染了siRNA-*1和siRNA-*2的細胞中，NK1R-Tr的蛋白表達量較轉染對照序列的細胞明顯下降，見圖6。在E2刺激的條件下，CCK-8結果顯示，從檢測的第4天開始，敲除NK1R-Tr組的MCF-7和T47D乳腺癌細胞的增殖能力明顯低于對照組，差異有統計學意義（4 d時，tMCF-7=3.700，tT47D=3.535，均P＜0.05；5 d時，tMCF-7=4.563，tT47D=4.316，均P＜0.05），見圖7。同樣在E2刺激的條件下，克隆形成實驗結果示，敲除NK1R-Tr組的MCF-7和T47D乳腺癌細胞的克隆形成能力較對照組明顯降低，差異有統計學意義（tMCF-7=4.028，tT47D=4.234，均P＜0.05），見圖8。

Fig.5 ERα and NK1R-Tr expressions in MCF-7 cells detected by RT-PCR圖5 ERα與NK1R-Tr在乳腺癌MCF-7細胞中表達的RT-PCR檢測（＊＊P＜0.01）

Fig.6 NK1R-Tr expression in breast cancer cells detected by Western blot assay圖6 敲除NK1R-Tr的乳腺癌細胞Western blot檢測

Fig.7 Results of CCK-8 assay of breast cancer cells after knocking out NK1R-Tr圖7 敲除NK1R-Tr的乳腺癌細胞的CCK-8實驗（＊P＜0.05）

Fig.8 Colony formation assay of breast cancer cells after knocking out NK1R-Tr圖8 敲除NK1R-Tr的乳腺癌細胞的克隆形成實驗（＊P＜0.05）

3 討論

根據ERα的表達情況可以將乳腺癌分為ERα陰性和ERα陽性兩大類，激活狀態的ERα會以同源二聚體的形式進入細胞核，與其靶基因啟動子上游的反應元件結合，從而調控靶基因的表達，促進細胞增殖［3,10］。ERα在乳腺癌早期的進展過程中扮演著重要的角色，了解ERα調控網絡的機制有助于建立針對ERα陽性乳腺癌的治療方案。有報道稱ERα通過調控E2依賴的轉錄作用提高了乳腺癌的患病風險，但由于對雌激素受體拮抗劑治療敏感，所以ERα陽性乳腺癌患者的生存率更高［11］。

速激肽家族的重要成員P物質（SP）通過激活并結合其偏嗜性受體NK1R發揮生物學效應，并且這種受體-配體復合物已被證實是抗腫瘤的獨立靶點［12-14］。NK1R主要分布在中樞神經和周圍組織，在乳腺組織也呈廣泛分布［15］。目前在mRNA和蛋白水平所發現的人NK1R只有2種：由5個外顯子組成的全長型受體（full-length，NK1R-FL）和C-末端缺乏96個氨基酸殘基的截短型受體（Truncated，NK1R-Tr），前期研究顯示其全長型變異體NK1RFL與乳腺癌細胞的侵襲轉移呈負相關；截短型變異體NK1R-Tr則隨著乳腺癌的進展表達不斷升高［16］。在ERα陽性的乳腺癌細胞中，ERα是否可以通過調控NK1R-Tr的表達，進而影響乳腺癌細胞的增殖能力尚不清楚。

本研究顯示，在ERα陽性的MCF-7和T47D細胞中敲除ERα后，NK1R-Tr在蛋白水平和mRNA水平的表達確有下降，說明ERα對NK1R-Tr有一定的調控作用，但是這種調控作用是如何實現的還不得而知。CHIP實驗結果證明在NK1R-Tr啟動子上游存在ERα的反應元件，結合熒光素酶報告基因實驗的結果可知，ERα可以通過結合到該反應元件上，對NK1R-Tr的表達起正性調控的作用。另外值得注意的是，敲除ERα組細胞在E2刺激的條件下，NK1R-Tr的表達略有所增高，可能是因為除ERα外，E2還可以通過其他旁路作用于NK1R-Tr，并升高其表達，但這種升高作用較經典的E2-ERα-NK1R的作用弱。CCK-8增殖實驗和克隆形成實驗結果顯示，小干擾敲除乳腺癌細胞內源性NK1R-Tr后，MCF-7和T47D細胞的增殖能力明顯降低，這說明NK1R-Tr的高表達確實與癌細胞高增殖能力相關。總之，本項研究所有結果均指向E2-ERα-NK1R的正性調控機制，并且這一機制可以增強癌細胞的增殖能力。

綜上所述，將NK1R-Tr調控細胞增殖的能力與ERα調控細胞增殖的機制聯系在一起，就是把SPNK1R所參與的體內神經調節與E2-ERα為代表的體內內分泌調控系統交聯起來，這一調控機制當中的任一環節出現異常調節，任一指標出現異常表達，均可以成為乳腺癌發生發展的潛在因素，所以明確這一調控網絡的確切機制可能為臨床乳腺癌患者的治療和判斷預后提供一定的理論依據。盡管E2-ERα-NK1R與乳腺癌進展之間的關系以及NK1R抑制劑的作用還有待進一步深入驗證，但ERα-NK1R-Tr調控通路已成為乳腺癌治療重要的潛在新靶點。

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（2016-10-18收稿 2016-11-07修回）

（本文編輯 李國琪）

Study on the regulation of ERα on NK1R-Tr in breast cancer cells

LIU Xiaobin,TONG Yingna,ZHANG Lufang,ZHOU Yunli△
Department of Clinical Laboratory,Cancer Institute and Hospital,Tianjin Medical University,National Clinical Research Center of Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China△

ObjectiveTo analyze the regulation of estrogen receptor α(ERα)on truncated neurokinin-1 receptor (NK1R-Tr),and the influence of this regulation on cell proliferation in estrogen receptor-positive breast cancer cell lines.MethodsThe chromatin immune coprecipitation(CHIP)was used to observe the transcriptional regulation function of ERα on NK1R-Tr in breast cancer cells.Luciferase reporter gene assay was used to verify whether ERα played a positive regulatory role in the expression of NK1R-Tr.Western blot assay and real-time-PCR were used to detect the expression of ERα and NK1R-Tr in breast cancer cells,MCF-7 and T47D,as well as the expression of NK1R-Tr protein and mRNA level.NK1R-Tr levels were also detected after using estradiol(E2,ERα agonist)and small interfering RNA(knock out ERα).CCK-8 and clone formation experimen were used to detect the proliferation ability of breast cancer cells after knocking out NK1R-Tr with small interfering RNAs.ResultsCHIP test and Luciferase reporter gene assay proved that ERα can positively regulate the expression of NK1R-Tr via the ERα sequences in the upstream of the NK1R-Tr gene promoter.The expression of NK1R-Tr at both protein level and mRNA level dropped in the estrogen receptor-positive breast cancer cell line MCF-7 upon knocking out ERα.After knocking out NK1R-Tr,the proliferation ability of estrogen receptorpositive breast cancer cells was lower than that of the control group.ConclusionThe ERα positively regulates the expression of NK1R-Tr,resulting in the increased cell proliferation in estrogen positive breast cancer cells.

breast neoplasms;cell line,tumor;estrogen receptor alpha;receptors,neurokinin-1;RNA,small interfering;chromatin immunoprecipitation;cell proliferation;luciferase reporter

R737.9

A

10.11958/20161193

國家自然科學基金資助項目（81201653）

天津醫科大學腫瘤醫院檢驗科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室（郵編300060）

劉曉彬（1990），女，碩士研究生，主要從事乳腺癌神經激肽受體表達調控的研究

△通訊作者E-mail:zhouyunli@tjmuch.com