組織培養誘發玉米自交系H99、A188和黃早四的變異研究

于曉明　王霞

摘要：本實驗利用AFLP技術對這三個玉米自交系的愈傷組織和再生苗進行遺傳變異分析。結果發現，H99的再生率最低，并且具有最多的遺傳變異；而A188和黃早四的愈傷組織再生率都很高，而且愈傷組織和再生苗的變異較少。說明玉米愈傷組織在組織培養過程中的基因組穩定性是與愈傷組織分化再生過程密切相關。

關鍵詞：玉米；組織培養；遺傳變異；AFLP

基金項目：吉林省教育廳科學技術研究項目（吉教科合字〔2012〕第475號）

中圖分類號： S513.03；S336 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.051

組織培養誘發的植物體細胞變異（也稱植物體細胞克隆變異），一般是指在植物細胞、組織或器官的離體培養狀態下發生的遺傳變異或表觀遺傳變異[1]，這些變異可以通過細胞分裂和植物再生而傳遞給后代。植物體細胞克隆變異的產生沒有種屬特異性，出現的頻率一般比較高，一個組織培養周期內可產生1%～3%的無性系變異，有時甚至能高達90%以上[2]。植物通過體細胞克隆變異，可產生一系列有益的新性狀，對植物品種改良和新品種選育具有重要的意義[3]。然而體細胞胚或通過不定芽繁殖的植株經常出現高頻率的體細胞克隆變異現象[4，5]，又使其成為微繁和遺傳轉化工作中需要克服的重大難題。本試驗通過AFLP分子標記技術對玉米玉米自交系H99、A188和黃早四在組織培養過程中發生的DNA序列變異的頻率和狀態進行分析，探討分析玉米體細胞克隆遺傳變異的發生規律。

1 材料和方法

1.1實驗材料

玉米自交系黃早四H99、A188和黃早四的種子苗、愈傷組織和再生苗。

1.2組織培養和再生

各玉米自交系在授粉后12天，取幼胚，誘導愈傷組織。誘導培養基：N6基本培養基+2.8克/升脯氨酸+1毫克/升 2，4-D+100毫克/升 水解酪蛋白+10毫克/升 硝酸銀+2%蔗糖+0.7%瓊脂（pH5.8），于25±1℃條件下，暗培養4周。繼代培養基：誘導培養基中添加2毫克/升 2，4-D，暗培養4周。分化培養基：N6基本培養基+1毫克/升 NAA+6%蔗糖+0.7%瓊脂（pH5.8），25±1℃、80umol·m-2·s-1光照強度、光照時間為14小時/天的條件下誘導再生苗。待再生苗長至2～3厘米高時取材。

1.3 DNA提取

分別采集種子苗、愈傷組織和再生苗的葉片，用改良的CTAB法[6]提取上述植物材料的基因組DNA。

1.4 AFLP分子標記分析

AFLP分子標記技術主要包括以下幾個環節：酶切連接、預擴增、選擇性擴增、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測[7]。使用的限制性內切酶為MseI和EcoRI。

2 結果

2.1 愈傷組織的誘導和植株再生

玉米幼胚接種到愈傷組織誘導培養基上以后，2天后幼胚開始膨脹，6天后就可見到開始生成愈傷組織，以后半個月內都可陸續見到愈傷組織的產生，黃早四的出愈率最低（42%），A188的最高（80%）（見表1）。雖然H99表現出了較好出愈率但是再生率很低，僅為22.9%。

2.2 AFLP分子標記檢測的遺傳變異

本實驗以20對引物分別對各基因型玉米的種子苗、愈傷組織（愈傷）和隨機選取的4株再生苗（R1-R4）DNA樣品進行了AFLP分析。結果表明A188、H99、黃早四分別產生826，790，904條帶，呈多態性的帶的條數分別為30，62，38（表2）。

以種子苗作為對照，供體來源相同的愈傷組織或再生植株，表現變異的遺傳位點在各個材料中表現并不一致（圖1）：其中A188在愈傷組織和再生苗中變異的頻率比較接近（1.5%～2.7%）；而H99的愈傷組織檢測到了較多的變異（6.2%），4株再生苗的變異相對下降（4.0%～4.5%）；黃早四來源的愈傷組織發生變異比較少（2.5%），而在其再生苗中的檢測到的變異更少（0.8%～1.5%）。另外，在A188的愈傷組織和再生苗中檢測到的變異中，以條帶新增的變異為主，而H99和黃早四的愈傷組織和再生苗的變異條帶沒有表現出這樣的傾向。

3 討論

在組織培養過程中，為排除由于激素濃度或外部條件的不同或是離體培養時間不同而造成的遺傳變異頻率的不同，本實驗對各個材料均采用一致的誘導、繼代、分化培養基和一致的培養條件，并且選擇相同培養時間的愈傷組織和再生苗。結果表明，玉米愈傷組織在組織培養過程中的基因組穩定性是與愈傷組織分化再生過程密切相關的，而且不同基因型玉米由組織培養誘導的遺傳變異頻率有較大差異。本實驗結果對于理解不同基因型玉米在組織培養并誘導再生過程中表現出來的巨大差異有很大幫助。

參考文獻

[1] Larkin P J， Scowcroft W R. Somaclonal variation - a novel source of variability from cell cultures for plant improvement[J]. Theo Appl Genet，1981， 60：443-455.

[2] Smith M K， Drew R A. Current applications of tissue culture in plant propagation and improvement[J]. Austral. J . Plant Physiol， 1990， 17：267-289.

[3] Bouman H， De Klerk GJ.Somaclonal variation. In： Geneve RL， Preece SE and Merkle SA （eds） Biotechnology of ornamental plants[M]. CAB Int， Wallingford， UK， 1997，165-189.

[4] 肖輝海， 陳良碧. 植物體細胞無性系變異育種[J]， 湖南文理學院學報（自然科學版）， 2003，15（04）：40-46.

[5] 刁現民， 孫敬三. 植物體細胞無性系變異的細胞學和分子生物學的發展. 植物學通報[J]， 1999， 16（04）：372～377.

[6] Moller E.， et al.， A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi， fruit bodies， and infected plant tissues. Nucleic Acids Research， 1992. 20（22）： p. 6115.

[7] 羅洋. 肥料和密度對玉米生長發育及DNA甲基化的影響[D]. 哈爾濱：東北農業大學， 2014.

作者簡介：于曉明，吉林農業科技學院，講師，研究方向：遺傳學與基因工程。