溶劑誘導相變萃取-UPC2快速測定中成藥及原料藥中的香豆素

王 波，周 圍*，馮 靜，杜明遠，劉倩倩

(1.甘肅出入境檢驗檢疫局 綜合技術中心，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省檢驗檢疫科學技術研究院，甘肅 蘭州 730000)

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溶劑誘導相變萃取-UPC2快速測定中成藥及原料藥中的香豆素

王 波1,2，周 圍1,2*，馮 靜1，杜明遠1，劉倩倩2

(1.甘肅出入境檢驗檢疫局 綜合技術中心，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省檢驗檢疫科學技術研究院，甘肅 蘭州 730000)

使用溶劑誘導相變萃取對中成藥及原料藥進行預處理，建立了中成藥中香豆素的超高效合相色譜(UPC2)檢測方法。樣品經粉碎(60目)、乙腈-水(7∶3 ，體積比)提取，二氯甲烷誘導分相后，使用UPC2對樣品中的香豆素進行檢測。以3倍信噪比(S/N)確定香豆素的檢出限為0.1 mg/L；線性范圍為0.3～10.0 mg/L；加標回收率為89.8%～102.3%；相對標準偏差為0.31%～1.0%。同時與UPLC進行比較，結果表明該方法的選擇性高，檢測成本低，且分析時間僅為UPLC的1/4。該研究為高通量檢測香豆素提供了一種全新的前處理及檢測方法。

香豆素；溶劑誘導分相萃?。怀咝Ш舷嗌V；超高效液相色譜；檢測

香豆素是廣泛分布于植物界中的次生代謝物質，常與生源密切的桂皮酸、黃酮類、木脂素等伴生，尤其是傘形科、蕓香科、菊科、豆科、蘭科和茄科等植物[1-2]。根據環上取代基及其位置的不同，常將香豆素分為簡單香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素和其他香豆素等。研究表明，香豆素及其衍生物除了具有抗癌、抗炎及抗凝血等生物學活性外，20世紀八九十年代，香豆素被公認為可能具有遺傳毒性的致癌物質，因此歐盟規定香豆素在食品及藥品中的含量不得高于2.0 mg/kg。2004年，新的研究證明，香豆素并不是遺傳毒性的致癌物質，但香豆素的一小部分成分具有肝毒性，在此基礎上，歐盟食品安全管理局公布了香豆素的日服用限量為0～0.1 mg/kg(按體重計算)[3-6]。為確保以肉桂及桂枝為中藥原料制成的中成藥順利出口及合理制定每日的口服劑量，對香豆素的檢測顯得尤為重要。

香豆素的測定方法一般有液相色譜法[1,7-10]、液相色譜-串聯質譜法[11-12]、氣相色譜-串聯質譜法[13-14]、紫外分光光度法[15]等，但紫外分光光度法測定香豆素的方法選擇性較差，易受其它成分的干擾，所需試劑較多、操作繁瑣。而對于液相色譜及串聯質譜，除了實驗成本較高外，有機溶劑的使用還會對環境造成污染。樣品預處理是中成藥及其原料等復雜基質中分離檢測目標物的重要環節。溶劑誘導相變萃取法已成功用于血漿樣品中痕量藥物的測定[16]。該方法與傳統液-液萃取法相比，具有操作簡單快速等優點，且新形成的有機相與常用的反相色譜流動相兼容，可直接進樣分析，無需在進樣前進行溶劑轉化。通過文獻查閱，該樣品處理方法尚未見用于中成藥中香豆素測定的報道。

超臨界流體(Supercritical fluid，SCF)是指物質高于其臨界溫度和臨界壓力時的一種物態，它既不是氣體，也不是液體，但兼有氣體的低粘度，液體的高密度，以及介于氣液體之間的擴散系數等特征。超高效合相色譜(Ultraperformance convergence chromatography，UPC2)是以超臨界流體為流動相，依靠流動相的溶劑化能力進行分離分析的一種分析技術；其在傳統超臨界流體色譜(Supercritical fluid chromatography，SFC)的原理上，應用超高效液相色譜(UPLC)的硬件技術，并使用更小的色譜柱填料(≤ 2 μm)達到快速、高效的分離[17-19]。SFC和UPLC的結合，克服了傳統SFC在實驗過程中精密度差、重現性低的缺點，在整個操作過程中有機溶劑使用量少，是一種綠色的分離技術。目前采用UPC2對香豆素進行快速檢測的方法尚未見報道。

本實驗通過建立一種新的中成藥前處理方法，即溶劑誘導相變萃取，利用分相后的高度選擇性對復雜基質中的香豆素進行檢測；文中還系統考察了UPC2對香豆素分離的影響因素，并與UPLC進行比較，相關研究為中成藥及其原料藥中香豆素的提取、分離及檢測提供新的思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效合相色譜儀(美國Waters公司)配二極管陣列檢測器，Waters Empower 3數據處理系統；移液槍(10～100 μL，100～1 000 μL，美國Thermo Electron公司)；分析天平；50 mL聚乙烯管。

香豆素(Dr.Ehrenstorfer公司，純度99%)；CO2(中國匯能公司，純度99.997%)；乙腈、甲醇(德國Merck公司)；蒸餾水(屈臣氏)；其余試劑均為分析純。

1.2 標準溶液配制

標準貯備液：準確稱取10.00 mg香豆素，用乙腈-水(7∶3)定容至100 mL容量瓶中，配制成100 mg/L的香豆素標準溶液。4 ℃下冷藏待用。

標準工作液：準確移取5.0，2.5，625，313，156，52 μL標準貯備液于50 mL容量瓶中，乙腈-水(體積比7∶3)準確定容，分別配制成10.00，5.00，1.25，0.62，0.31，0.10 mg/L的標準工作液。4 ℃下冷藏待用。

1.3 色譜條件

色譜柱：UPC2CSH Fluoro-Phenyl(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流動相A為CO2；B為含0.2%甲酸的甲醇溶液；流速0.5 mL/min，進樣體積1.0 μL，柱溫50 ℃，檢測波長278 nm，動態背壓(ABPR)為1 900 psi。梯度洗脫：0～3.0 min，98%～90% A；3.0～4.5 min，90%～80% A；4.5～5.5 min，80%～70% A；5.5～6.0 min，70%～98% A；6.0～8.0 min，98%A平衡2 min。

1.4 樣品來源

不同種類的中成藥(T1～T5)及原料藥均由某制藥廠提供，所有樣品粉碎后待用。

1.5 樣品預處理

稱取0.50 g(精確至0.01 g)粉碎后的樣品于50 mL聚乙烯管中，準確添加35 mL乙腈-水(7∶3)提取液，渦旋2.0 min，超聲提取15 min后準確加入5.0 mL二氯甲烷，渦旋2.0 min，4 ℃條件下13 000 r/min冷凍離心10 min。離心完畢后，溶液分層，上層為乙腈層，下層為水層，取乙腈層溶液1.5 mL，過0.22 μm有機相膜，待測定。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 提取溶劑及提取條件的選擇 為了完全提取中成藥及原料藥中的香豆素，本實驗稱取同一中成藥樣品適量，料液比為1∶50(g/mL)，分別加入50%，60%，70%，80%及90%的乙腈水溶液進行超聲提取。結果表明，當使用70%乙腈-水溶液對樣品進行超聲提取時，待測樣品中香豆素的濃度最高，為376.17 mg/L。固定提取溶劑不變，考察了超聲提取時間(5，15，25，35 min)和提取次數(1，2，3，4次)以及料液比(1∶30，1∶50，1∶70，1∶90)對香豆素提取率的影響。結果表明，在最佳提取條件下(即提取溶劑為70%乙腈水溶液，料液比為1∶70，超聲15 min提取1次)，樣品中香豆素的提取效率最高，提取濃度達到414.85 mg/L。

2.1.2 誘導分相劑的選擇 有文獻報道，幾乎所有與乙腈互溶的疏水性溶劑都能作為誘導分相劑誘導乙腈-水體系分層[16]，因此，本實驗選擇具有代表性的不含氧誘導劑如二氯甲烷、無機鹽如氯化鈉及含氧誘導劑如正辛醇對香豆素標準溶液(1.25 mg/L)進行誘導分相萃取，比較了水層和乙腈層中香豆素的含量，并通過計算回收率確定香豆素的轉移率。結果顯示，采用正辛醇作為誘導分相劑進行提取時，目標物的回收率較低，僅為74.2%，使用二氯甲烷和氯化鈉進行誘導分相，香豆素的回收率均在95%以上，表明香豆素已高選擇性地轉移至乙腈層中。此外，使用氯化鈉作為誘導分相劑時，水層高濃度的鹽不利于UPC2對水層化合物的分析。故實驗選擇二氯甲烷作為誘導分相劑。

2.1.3 色譜柱的選擇 由于中成藥及原料藥中的成分極其復雜，色譜柱對目標物的保留、峰形及選擇性起著至關重要的作用。樣品按“1.5”處理后，使用3種不同的色譜柱BEH(3.0 mm×100 mm，1.7 μm)，BEH 2-EP(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)及CSH Fluoro-Phenyl(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)對樣品乙腈層中的香豆素進行分離檢測。結果表明，當使用BEH及BEH 2-EP色譜柱時，受雜質的干擾，嚴重影響香豆素定量的準確性，采用CSH Fluoro-Phenyl色譜柱時，乙腈層中的香豆素無任何雜質的干擾。故本實驗選擇的色譜柱為CSH Fluoro-Phenyl柱。

2.1.4 流速的選擇 使用超臨界CO2作為流動相時，相比傳統的正相及反相色譜的流動相，它具有低粘度和高擴散系數，以及較小的粘度，從而減小了分離過程中的阻力。在相同的色譜柱條件下，可使用較高的流速?？紤]到流速主要對分析時間和系統壓力產生影響，本實驗在0.3，0.5，0.8，1.0 mL/min范圍內進行考察，在保證理想的分析時間和系統壓力的前提下，最終選擇0.5 mL/min為最佳流速。

2.1.5 助溶劑的選擇 以CO2超臨界流體為流動相時，通常對極性化合物的洗脫能力較弱，可通過加入甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇及揮發性酸或鹽作為助溶劑來增加對極性化合物的洗脫能力，以適應對不同極性目標化合物的分離，并得到較好的峰形及理想的保留時間。本實驗考察了甲醇、乙腈兩種最為常見的助溶劑對香豆素的分離效果。結果顯示，使用乙腈作為助溶劑時，峰形拖尾嚴重，且保留時間達10 min ，使用甲醇作為助溶劑時，香豆素的保留時間為2.69 min，但香豆素仍有拖尾，而通過在甲醇加入0.2%甲酸，可得到較好的峰形，保留時間稍有提前(2.47 min)，故選擇含0.2%甲酸的甲醇溶液作為助溶劑。

2.1.6 動態背壓(ABPR)的選擇 超臨界流體在不同壓力下有不同的溶解能力，其溶解能力隨壓力的增加而增加，故壓力是影響分離過程的重要因素之一。動態背壓(ABPR)可在整個運行過程中維持CO2的超臨界流體狀態，實驗考察了ABPR在1 600，1 700，1 900，2 000 psi條件下對樣品分離的影響。結果表明：隨著背壓升高，系統壓力隨之升高，系統超臨界流體溶解度的增加使得香豆素的保留時間減少。當背壓為1 900 psi時，香豆素與雜質得到很好分離，且保留時間短、色譜峰形對稱，故選擇背壓為1 900 psi。

2.1.7 色譜柱溫度的選擇 在超臨界流體狀態下，SCF的溶解能力隨溫度的增加而降低。實驗考察了30，40，50，60 ℃的條件下對目標物分離的影響。結果表明，隨著溫度的升高，香豆素的保留時間逐漸增加，在此前提下，綜合考慮樣品中雜質與香豆素的分離程度以及每個樣品的分析時間，本實驗選擇50 ℃為最佳分離溫度。

2.2 UPC2的方法學考察

2.2.1 穩定性實驗 準確稱取編號為T4的中成藥樣品0.50 g，按“1.5”方法處理樣品，在“1.3”色譜條件下，分別在0，4，12，24，48 h進樣6次，T4樣品中香豆素的峰面積相對標準偏差(RSD)分別為0%，0.38%，0.44%，0.61%，0.69%和0.66%。表明樣品溶液在48 h內穩定。

2.2.2 專屬性實驗 取標準溶液、陰性供試品溶液以及中成藥樣品的乙腈層溶液，按“1.3”色譜條件進樣分析并比較，結果顯示，香豆素的出峰位置無雜質干擾，表明該方法的專屬性較好。

2.2.3 線性范圍及定量下限 按“1.2”分別配制成10.00，5.00，1.25，0.62，0.30，0.10 mg/L的標準工作液。按照“1.3”色譜條件，每個濃度進樣1.0 μL，以濃度(x,mg/L)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，進行線性回歸。結果表明，香豆素在0.3～10.0 mg/L范圍內線性關系良好，線性方程為y=153.8x+8.74；根據信噪比(S/N)為3和10確定香豆素的檢出限和定量下限分別為0.1 mg/L和0.3 mg/L。

2.2.4 精密度實驗 按照“1.3”所述色譜條件，對添加高、中、低3個不同濃度(10.00，1.25，0.30 mg/L)香豆素標準溶液的中成藥樣品重復進樣6次，測得日內精密度的RSD為0.31%～0.63%；日間精密度的RSD為0.49%～0.92%，可以看出該方法對檢測中成藥及原料藥中的香豆素具有較好的日間和日內精密度，能滿足對香豆素的檢測要求。

2.2.5 重復性實驗 準確稱取同一中成藥樣品，按“1.5”方法進行樣品處理，“1.3”色譜條件進樣分析，計算香豆素的含量及RSD。6份同一中成藥樣品中香豆素含量的RSD為1.0%，表明方法的重復性較好。

2.2.6 加標回收率 準確稱取同一中成藥樣品，分別加入高、中、低3個不同濃度(10.00，1.25，0.30 mg/L)的香豆素標準溶液，在優化條件下進樣分析。結果顯示，3個不同濃度的香豆素加標回收率為89.8%～102.3%，表明本方法準確可靠。

2.3 與UPLC方法的比較

按照“1.5”對樣品處理后，采用相同色譜柱CSH Fluoro-Phenyl(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)，使用UPLC儀進樣2.0 μL進行分析，流動相為0.2%甲酸甲醇和水溶液，梯度洗脫，278 nm下檢測。另取相同的供試品溶液按“1.3”色譜條件分析，分別得到香豆素標準溶液的UPC2和UPLC色譜圖(見圖1)。由圖可以看出，UPC2與UPLC相比，因為流動相性質及保留機理的不同，香豆素標準溶液在UPC2的出峰時間(2.15 min)較UPLC的出峰時間(8.52 min)縮短了近4倍。由此可見，本實驗建立的UPC2快速檢測中成藥中香豆素的方法與傳統液相色譜方法相比，既節省溶劑，降低檢測成本，又能進行快速分離，實現高通量檢測。

2.4 實際樣品的測定

取5批中成藥及2批原料藥樣品經粉碎后(60目)，準確稱取0.50 g，按“1.5”進行樣品處理，在“1.3”色譜條件下進樣分析，圖2為樣品T4總提液、乙腈層以及水層的色譜圖；每個樣品重復3次，通過光譜圖確定峰純度，外標法計算香豆素的含量，樣品中香豆素的含量結果見表1。由表1可知，除樣品T2未檢出香豆素外，其余中成藥均檢出香豆素，且T4樣品的濃度最高，達到414.58 mg/L；對于原料藥的分析結果顯示，肉桂中香豆素的濃度為2 144.29 mg/L，約為桂枝的4倍。此外，通過UPC2和UPLC對樣品檢測結果的比較，表明UPC2的檢測結果除了與UPLC具有相當的準確度外，檢測時間僅為UPLC的1/4，故使用UPC2可對香豆素進行快速準確、高通量的檢測。

SampleDetectionresultsofUPC2(mg/L，n=3)DetectionresultsofUPLC(mg/L，n=3)Rawmaterials(原料藥)CassiaTwig(桂枝)6334662875Cinnamon(桂皮)241129249801Chinesetraditionalmedicine(中成藥)T138573982T2-?-T333783503T44145841759T541314364

*no detected

3 結 論

本文采用二氯甲烷作為誘導劑對樣品中的香豆素進行萃取，香豆素可高選擇性地存在于乙腈層中，并且在萃取過程中無需特殊裝置，操作簡便，是一種穩定可靠的分析方法。同時，首次采用UPC2建立了檢測中成藥及原料藥中香豆素的方法，方法學考察結果顯示，該方法的靈敏度高，重現性、穩定性良好，檢測時間短，為中藥復雜體系的色譜分析提供了新的方向。通過與UPLC比較，分析時間僅為UPLC的1/4，可節約大量的分析時間，提高檢測效率。采用所建立的最佳色譜方法對5批中成藥及2批原料藥材進行了測定，實驗結果顯示肉桂和桂枝中香豆素的含量較高，為確保以肉桂及桂枝為中藥原料制成的中成藥順利出口及合理制定每日口服劑量提供了數據支持。

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Rapid Determination of Coumarin in Chinese Traditional Patent Medicine and Raw Materials by UPC2and Solvent Induced Extraction

WANG Bo1,2，ZHOU Wei1,2*，FENG Jing1，DU Ming-yuan1，LIU Qian-qian2

(1.Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lanzhou 730000，China；2.Gansu Province Inspection and Quarantine Science and Technology Research Institute，Lanzhou 730000，China)

A method of solvent induced phase extraction and ultra performance convergence chromatography(UPC2) was established for the determination of coumarin in Chinese traditional patent medicine and raw materials.Samples were crushed(60 mesh)，and extracted with acetonitrile-water(7∶3,by volume) using dichloromethane as induced separation solvent.The targeted compound was detected by UPC2method.The limit of detection(LOD,S/N=3) for coumarin was 0.1 mg/L.The linear range of coumarin was in the range of 0.3-10.0 mg/L.The spiked recoveries ranged from 89.8% to 102.3% and the relative standard deviations were between 0.31% and 1.0%.Compared with UPLC method，the method showed the advantages of high selectivity and low detection cost，and its analysis time is only 1/4 of the UPLC.This study provided a new pretreatment and detection method for the high throughput detection of the coumarin.

coumarin;solvent induced extraction；ultra performance convergence chromatography(UPC2)；ultra performance liquid chromatography(UPLC)；detection

2016-05-18；

2016-06-29

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.019

O657.72；TQ460.72

A

1004-4957(2016)12-1622-06

*通訊作者：周 圍，博士，研究員，研究方向：色譜分析、食品藥品安全及檢測，Tel:0931-8513950，E-mail:zhouwei845@163.com