基于藍光技術的數字化分子診斷與檢測技術

徐鵬濤,師茂林,張玲玲,張校亮,李曉春

(太原理工大學 物理與光電工程學院，新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點實驗室，山西 太原 030024)

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基于藍光技術的數字化分子診斷與檢測技術

徐鵬濤,師茂林,張玲玲,張校亮,李曉春*

(太原理工大學 物理與光電工程學院，新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點實驗室，山西 太原 030024)

該文基于課題組前期對CD/DVD技術的生物光盤檢測技術的研究基礎上，建立了基于全新的BD技術的分子定量檢測技術。與CD和DVD相比，BD光驅具有更小的激光聚焦光斑，實現了更高的檢測通量與檢測靈敏度。通過在藍光光盤表面制備大小和灰度不同的墨點陣列，并利用標準BD光驅結合光盤質量診斷軟件進行測試，分析了系統的橫向分辨率以及用于定量檢測的可行性，結果表明藍光檢測系統具有較高的靈敏度和橫向分辨率(<100 μm)。在BD光盤表面成功制備了生物素—鏈霉親和素結合反應陣列，利用標準BD光驅以及糾錯軟件，實現了對鏈霉親和素的定量檢測。

藍光光驅/光盤；質量診斷；靈敏度；即時檢測

傳統的生物分子診斷方法存在耗時長、成本昂貴、操作復雜等缺點，因此，許多研究集中于開發面向普通用戶的低成本即時檢測(POC，Point of care)設備，如早早孕試紙條、比色卡、血糖儀等定性或定量的檢測裝置[1-2]。

利用常見的消費類電子設備如手機、掃描儀、數碼相機等，使普通用戶快速有效地實現分子診斷或有害物質檢測，是近年來的研究熱點[3-4]。計算機光驅/光碟播放機作為一款普及性較高的數字化讀取設備，具有精密的光學讀取機制和伺服控制系統，而普通光盤又可替代傳統的硅片、玻璃片等作為生物分子反應的基底，在此基礎上，國內外已有許多對利用光驅讀取生物光盤的探索研究，并研發了不同的檢測體系，從技術實現的角度，主要分為兩類：通過對光驅硬件的改造以及本課題組提出的基于標準光驅/光盤的數字化分子檢測技術。Lange 等[5]利用改裝過的CD光驅激光探頭實現了免疫檢測反應的定量分析；Potyrailo等[6]直接從CD光驅的光電探測器提取模擬信號，實現了對金屬離子的定量檢測，Ramachandraiah等[7]在標準光驅上增加光電探測器，將光驅改裝成激光掃描顯微鏡，對CD4+細胞進行成像，這類技術由于對光驅進行了改造，因此普通用戶無法利用標準光驅進行檢測。于化忠課題組在2008年提出了基于標準光驅/光盤技術的數字化分子檢測技術[8-10]，該方法借助于CD光盤數據保護機制，利用CD標準光驅結合光盤質量診斷軟件實現定量檢測。在此基礎上，本課題組將這一基于標準光驅/光盤的數字化分子檢測技術從CD系統發展到DVD系統[11]，并實現了孕酮hCG[12]、毒品嗎啡和可卡因[13]以及重金屬離子[14]的高靈敏度定量檢測。

隨著存儲需求的增加，光盤技術已由DVD迅速發展到BD(Blu-ray disc)。與DVD技術相比，BD采用更短的激光波長和更高的數值孔徑，使聚焦光斑尺寸大大縮小，記錄密度增加[15]。對基于光驅的檢測技術而言，更小的光斑意味著更高的檢測通量和靈敏度，基于此，本文研究了基于BD技術的數字化分子檢測方案，利用BD表面內酯的水解反應，成功地將惰性BD轉化為有活性的生物基底，并用標準藍光光驅結合光盤質量診斷軟件，實現了BD表面生物素—鏈霉親和素反應的定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

紫外臭氧清洗機(PSD-UV，美國Novascan Technologies公司)，超純水系統(Genpure UV，美國Thermo公司)，電子天平(美國Ohaus公司)，微量移液槍(瑞士梅特勒公司)，藍光一次性寫入盤(25GB BD-R，日本威寶公司)，藍光刻錄機(PX-LB950UE，日本浦科特公司)。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、2-嗎啉乙磺酸(MES)、吐溫20、明膠(美國Sigma-Aldrich公司)；氯化鈉、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、牛血清蛋白(BSA)、氫氧化鈉(美國Aladdin公司)；疊氮化鈉(NaN3，北京索萊寶科技有限公司)；氨基修飾的生物素(EZ-link@Amine-PEG2-biotin，美國Thermo Scientific公司)；納米金-鏈霉親和素結合物(Nanogold-streptavidin conjugate)、銀染試劑盒(美國Nanoprobes公司)。實驗用水為超純水(18.20 MΩ·cm)。

1.2 實驗方法

1.2.1 墨點陣列的制備與讀取 使用藍光刻錄機和Blu-ray Disc Suite刻錄軟件(訊連科技有限公司)將高清格式的電影(22GB)刻錄到光盤上。利用帶有前置托盤的噴墨打印機(R270，日本愛普生有限公司)將墨點陣列打印在光盤表面，配套的Print CD用來設計打印樣式和控制打印過程，本文設計了兩種類型的墨點陣列：第一種為大小不一、灰度一致的墨點陣列；第二種為大小一致、灰度不同的墨點陣列。利用標準光驅結合光盤質量診斷軟件PlexUtilities(v 1.3.3，http://plextoramericas.com)對光盤進行讀取，速度為4X。

1.2.2 生物素—鏈霉親和素反應陣列的制備與讀取 首先將BD表面浸泡在0.1 mol/L的NaOH溶液中，溫度為(55±1) ℃，水解90 min，用水徹底沖洗光盤表面并用氮氣吹干，然后將光盤浸泡在活化液(100 mmol/L EDC，25 mmol/L NHS，溶劑為pH 5.8的MES緩沖液)中，活化4 h。在光盤表面覆蓋聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流體通道板，將生物素溶液注入微通道中，固定8 h后，將緩沖液(pH 7.4，所含成分為150 mmol/L NaCl，0.8% BSA，0.1% gelatin，0.05% Tween 20，0.05% NaN3)注入通道，封閉2 h，隨后將不同濃度的納米金-鏈霉親和素結合物依次注入不同的通道中，靜置1 h，用銀染液(48 mmol/L乙酸銀和182 mmol/L對苯二酚)對反應區域銀染5 min，徹底沖洗光盤并用氮氣吹干后，對光盤進行讀取，讀取過程與“1.2.1”方法相同。

圖1 藍光系統糾錯塊示意圖Fig.1 Schematic representation of the error correction code(ECC) block in a Blu-ray system

2 結果與討論

2.1 BD質量診斷原理

BD系統以糾錯塊的形式對數據進行保護。圖1是一個糾錯塊的示意圖，白色部分代表用戶數據，容量為64 kB；藍色部分代表用戶數據的校驗碼；其余4列稱為警哨列。用戶數據受到長距碼(Long Distance Code，LDC)的保護，長距碼由304個LDC碼字組成，這些碼字按照2×2的方式進行排列，形成一個496行×152列的矩陣塊；糾錯塊最左側的一列由同步位形式構成，其余3列由地址信息、控制信息及其校驗碼組成，地址信息、控制信息受到突發指示子碼(Burst Indicating Subcode，BIS)的保護，突發指示子碼由24個BIS碼字構成，BIS碼字經過交錯交叉，形成一個496行×3列的矩陣塊，由于BIS列和同步位列均可以指示長度不小于40字節的突發錯誤的位置，因此統稱為警哨列。對于藍光系統而言，糾錯塊是基本的數據質量測試單元，光盤質量診斷軟件有兩個測試參數：LDC和BIS，其中LDC代表每個糾錯塊中LDC碼字發生校驗錯誤的個數，BIS代表每個糾錯塊中BIS碼字發生校驗錯誤的個數。

2.2 墨點陣列的分析

為了研究藍光檢測系統的橫向分辨率，首先對第一種墨點陣列進行測試。如圖2所示，在光盤表面打印4組直徑分別為0.1，0.2，0.3，0.4 mm的墨點；在LDC和BIS模式下均出現8個明顯的檢測信號，且隨著墨點直徑的增加，檢測信號的幅值和寬度均增加，并且LDC模式下的信號強度是BIS模式下的50倍之多，這是由于LDC碼字中用戶數據占碼字總容量的87%，對于表面物質會更加敏感，因此本文選用LDC作為檢測參數。由實驗結果得知，藍光檢測系統的橫向分辨率在100 μm以下，遠優于DVD系統[11-12]。

圖3 光盤表面墨點的邏輯位置與物理位置的關系圖Fig.3 Relationship between radial distance and logical position of the ink-spots on a BD

由于檢測結果橫坐標是光盤的邏輯位置，而在多樣品的測試中，樣品的物理位置更易于觀察，基于存儲容量正比于存儲面積這一原理(存儲密度不變)，可獲得光盤物理位置與邏輯位置轉換關系式：

在上述實驗基礎上，為了驗證藍光系統作為生物化學分子定量檢測系統的可行性，進一步對第二種類型即尺寸一致但灰度不同的墨點陣列進行檢測與分析，如圖4A所示，隨著墨點顏色的加深，信號幅值增加，而寬度(1.4±0.1) mm保持不變。隨后比較了墨點引起的光學灰度比(ODR，Optical darkness ratio)與LDC 密度(單位面積內的LDC個數)的關系。傳統的ODR檢測方法的表達式為[16]：ODR=(Ib-Is)/Ib，式中，Ib代表背景的灰度，Is代表反應陣列的灰度。如圖4B所示，當ODR從0.14增至0.23時，錯誤數密度增加較快，當ODR從0.23增至0.52時，錯誤數密度增加較慢，與DVD系統觀察到的線性關系不同[11-13]。這是由于藍光檢測系統的糾錯模式更加靈敏[15]，所以當墨點顏色在較淺范圍內變化時，激光光強的變化導致 LDC變化較快，而當墨點顏色在較深范圍內變化時，大部分激光被吸收，使得LDC變化較慢。

2.3 BD系統對生物素——鏈霉親和素反應的定量檢測及其與DVD系統的比較

鏈霉親和素又稱抗生物素蛋白，因其和生物素之間有著很強的非共價作用(Ka≈1015mol-1·L)，所以生物素——親和素反應系統在生物分子檢測中常被作為模型診斷工具[8-9,11]。圖5頂部插圖為經過銀染后的生物光盤的光學圖片，從光盤外圈到內圈，圖中標號1～7的條帶濃度分別為0.0，0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 μg/mL。從圖5可以看出，隨著鏈霉親和素濃度的增加，銀染條帶亮度逐漸增強。圖5A為生物光盤在LDC模式下的檢測結果，隨著鏈霉親和素濃度的升高，檢測信號的幅值迅速增強，當濃度增至0.8 μg/mL時，檢測信號達到飽和。圖5B中實線為LDC 密度隨鏈霉親和素濃度變化的關系，可以看出隨著濃度的上升，LDC密度迅速增加，當濃度達到0.8 μg/mL后，LDC密度趨于飽和。

進一步考察了PIF(DVD系統中的糾錯參數)密度與分析物濃度的關系，結果如圖5B所示，隨著分析物濃度的增加，PIF 密度的增長速度比LDC密度緩慢，直至分析物濃度達1.0 μg/mL時，PIF 密度才趨于飽和。由結果可知，BD系統可檢測到的鏈霉親和素的最低濃度小于0.1 μg/mL，比DVD系統的檢出限(0.2～0.4 μg/mL)更低，且檢測靈敏度高于DVD系統，但隨著分析物濃度的增加，BD系統的檢測信號更易達到飽和。

相較于DVD系統，BD系統能夠實現低檢出限和高靈敏度的主要原因有：①由于BD系統采用比DVD系統更短波長的藍色激光(405 nm)和更高數值孔徑的物鏡，使得光驅在讀取BD光盤時其表面光斑面積只有讀取DVD光盤時表面光斑面積的1/14，所以低濃度的銀染條帶會對BD系統的檢測光斑產生更大的消光作用(例如散射和吸收等)，使BD更易產生校驗錯誤；②由于BD的存儲密度(25 GB)是DVD(4.7 GB)的5倍之多，所以同樣大小的銀染條帶覆蓋的BD字節數更多；③藍光檢測系統的糾錯模式更加靈敏。

3 結 論

本文提出了基于藍光技術的數字化分子檢測方案，通過對光盤表面微尺度墨點陣列的分析，表明了藍光檢測系統的橫向分辨率小于藍光光盤表面的光斑直徑(138 μm)，可以檢測出直徑小于100 μm的墨點；通過對生物素——鏈霉親和素結合反應的分析，得出相較于DVD系統，BD系統能夠取得較低的檢出限和較高的靈敏度，這是由于其采用了更短波長的藍色激光和更高數值孔徑的目鏡以及BD存儲密度的大幅提升和更加靈敏的藍光檢測系統糾錯模式，使其可以成為應用于現場分析的低成本即時檢測工具。

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Digitized Molecular Detection Based on Blu-ray Technology

XU Peng-tao，SHI Mao-lin，ZHANG Ling-ling，ZHANG Xiao-liang，LI Xiao-chun*

(Key Laboratory of Advanced Transducers and Intelligent Control System(Ministry of Education and Shanxi Province)，College of Physics and Optoelectronics，Taiyuan University of Tecnnology，Taiyuan 030024，China)

The rapid quantitative detection of biochemical molecule has the advantages of simple handling，rapid detection and easy on-site analysis，thus it has a widespread application prospect in many fields such as medical diagnosis，food safety and environment monitoring.Molecular detection technology based on optical disc and optical drive can be used as the next generation molecular diagnostic tool.In this paper，a bran-new quantitative detection of molecule based on bio-disc(BD) was proposed and studied around our previous research on BD detection based on CD/DVD technology.Compared with CD and DVD，Blu-ray drive has a smaller focus laser size，which means higher detection throughput and sensitivity.The quantitation capability and the lateral resolution of this system were evaluated by preparing ink-spot arrays with different sizes and darkness on the surface of BDs which were subsequently examined with a standard Blu-ray drive in conjunction with disc quality check software，and the Blu-ray detection system exhibits the higher sensitivity and lateral resolution(<100 μm).In the end，biotin-streptavidin binding assay was successfully prepared on the surface of BDs，and the quantitative detection of streptavidin was achieved by a standard Blu-ray drive in conjunction with disc quality check software.

Blu-ray drive/disc；quality check；sensitivity；point of care

2016-03-10；

2016-07-10

國家自然科學基金項目(61174010，21505098，21575098)；山西省國際合作項目(2015081019);山西省平臺基地和人才專項 優秀人才科技創新項目(201605D211033)；山西省高等學校科技創新項目(2015123)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.015

O656.3;Q563.7

A

1004-4957(2016)12-1601-05

*通訊作者：李曉春，博士，教授，研究方向：光電分子檢測技術，Tel:0351-3176638，E-mail:lixiaochun@tyut.edu.cn