香菇液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

魏雅冬，王廣慧，李賀，李艷芳，胡畔

（綏化學(xué)院農(nóng)業(yè)與水利工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

香菇液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

魏雅冬，王廣慧，李賀，李艷芳，胡畔

（綏化學(xué)院農(nóng)業(yè)與水利工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

以大小香菇為試驗(yàn)材料，以發(fā)酵液中香菇粗多糖含量為測(cè)定指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定該供試菌株液體發(fā)酵的最佳條件。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為裝液量100 mL，接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，發(fā)酵時(shí)間7 d。此條件下發(fā)酵液中香菇粗多糖含量可達(dá)1.785 3 g/100 mL。

香菇；液體發(fā)酵；優(yōu)化；正交試驗(yàn)

香菇為側(cè)耳科植物香蕈的子實(shí)體，是我國(guó)主要的食用菌出口產(chǎn)品，其味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有18種氨基酸，藥用效果顯著[1]。多項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果表明，從香菇子實(shí)體提煉出來(lái)的香菇多糖對(duì)癌癥的治療有一定的效果[2]，被稱(chēng)為“保健食品”。目前，香菇的大面積栽培采用的仍為固體三級(jí)菌種，整個(gè)制種周期比較長(zhǎng)，而且容易遭受污染。為此，一些食用菌研究者開(kāi)始研究使用香菇液體菌種，這樣可以使菌種的生產(chǎn)周期變短，投入降低，為食用菌的工廠化生產(chǎn)提供了良好的菌種來(lái)源，是食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

不同產(chǎn)地的香菇菌種液體發(fā)酵條件不盡相同，本試驗(yàn)主要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室液體搖瓶發(fā)酵條件的初步研究，以找到適合綏化地區(qū)目標(biāo)菌種的優(yōu)化發(fā)酵條件，旨在為下一步小型罐體發(fā)酵提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大小香菇由綏化學(xué)院食用菌研究所提供。試驗(yàn)在綏化學(xué)院農(nóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試劑及儀器

試劑：玉米粉、蛋白胨、麥麩、瓊脂粉、牛肉膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、馬鈴薯等。培養(yǎng)基：PDA固體斜面培養(yǎng)基；液體發(fā)酵培養(yǎng)基（麥麩100%、磷酸二氫鉀0.1%、玉米粉2%、硫酸鎂0.2%）。儀器及用具：全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋、電磁爐、數(shù)顯恒溫?fù)u床、電子天平、量筒、燒杯、三角瓶、玻璃棒、醫(yī)用紗布等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化用無(wú)菌接種鏟從大小香菇母種斜面試管內(nèi)取0.5 cm2的菌塊，接種在事先制備好的PDA斜面試管內(nèi)，在恒溫培養(yǎng)箱（25℃）培養(yǎng)10 d，待菌絲長(zhǎng)滿管后，挑取菌絲潔白、健壯、無(wú)污染的活化菌種進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.3.2 液體搖瓶種子的制備在250 mL三角瓶?jī)?nèi)裝100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)液，121℃條件下滅菌30 min。將活化菌種無(wú)菌操作切取0.5 cm2菌塊4塊，接入液體搖瓶中，用無(wú)菌紗布封口。于25℃，120 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)7 d。若培養(yǎng)液無(wú)渾濁、菌球大小均勻，即可作為搖瓶種子。

1.3.3 單因素試驗(yàn)在已優(yōu)化的液體培養(yǎng)基內(nèi)，結(jié)合最初的培養(yǎng)條件，進(jìn)行搖床轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量和發(fā)酵時(shí)間的單因素試驗(yàn)，以發(fā)酵液中香菇粗多糖含量為指標(biāo)[3-4]，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，以確定基本的發(fā)酵條件。

1.3.3.1 裝液量單因素試驗(yàn)將配制好的液體發(fā)酵培養(yǎng)基90，100，110，120，130，140 mL分別裝入250 mL三角瓶?jī)?nèi)，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液中香菇粗多糖的含量。

1.3.3.2 接種量單因素試驗(yàn)在已配制好的100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，分別按照5%，8%，10%，12%，15%的接種量[5-6]接入制備好的液體菌種，測(cè)定培養(yǎng)后發(fā)酵液中香菇粗多糖的含量。

1.3.3.3 搖床轉(zhuǎn)速單因素試驗(yàn)在100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，液體菌種按10%（體積比）的接種量接種，分別在轉(zhuǎn)速為100，110，120，130，140 r/min的搖床上培養(yǎng)，測(cè)定香菇粗多糖的含量。

1.3.3.4 發(fā)酵時(shí)間單因素試驗(yàn)將接種量為10%的種子接種在100 mL發(fā)酵液內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為110 r/min，分別在發(fā)酵的第3，4，5，6，7，8，9，10天取發(fā)酵液測(cè)定香菇粗多糖的含量。

1.3.4 正交試驗(yàn)以裝液量、發(fā)酵時(shí)間、接種量、搖床轉(zhuǎn)速為因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)（表1），以發(fā)酵液中香菇粗多糖含量為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵條件。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

1.4 香菇粗多糖含量的測(cè)定

取上述發(fā)酵上清液加4倍體積的95%乙醇，于4℃下靜置24 h，在4 000 r/min下離心10 min，收集沉淀，用無(wú)水乙醇洗滌，低溫干燥得到發(fā)酵液粗多糖[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 裝液量對(duì)香菇液體發(fā)酵條件的影響

從圖1可以看出，裝液量在100 mL時(shí)發(fā)酵液中香菇粗多糖含量最高，達(dá)1.813 g/100 mL，裝液量超過(guò)100 mL時(shí)，發(fā)酵液中粗多糖含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因是裝液量過(guò)大，三角瓶?jī)?nèi)溶氧減少，會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成，所以，合適的裝液量為100 mL。

2.2 接種量對(duì)香菇液體發(fā)酵條件的影響

接種量的大小與菌種在發(fā)酵液中生長(zhǎng)繁殖的速度有關(guān)。接種量大，菌種生長(zhǎng)繁殖速度快，可縮短發(fā)酵時(shí)間；接種量不足，則會(huì)使發(fā)酵前期菌絲量少，菌體生長(zhǎng)緩慢，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間[8]。由圖2可知，不同接種量對(duì)大小香菇的生長(zhǎng)和發(fā)酵液粗多糖的含量有一定影響。接種量在5%～10%時(shí)，隨接種量不斷增大，發(fā)酵液中香菇粗多糖含量也在增加，且接種量為10%時(shí)，粗多糖含量達(dá)到最大，為1.763g/100mL。接種量超過(guò)10%時(shí)，粗多糖含量有下降趨勢(shì)，鑒于發(fā)酵成本考慮，最適接種量為10%。

2.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)香菇液體發(fā)酵條件的影響

由圖3可知，搖床轉(zhuǎn)速在110 r/min時(shí)發(fā)酵液中香菇粗多糖含量最高，為1.791 g/100 mL，隨著搖床轉(zhuǎn)速增加，發(fā)酵液中香菇粗多糖含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是因?yàn)閾u床轉(zhuǎn)速越高，雖然有利于增加溶氧和通氣效果，但增加了菌體之間的剪切作用，加大了對(duì)菌絲球的機(jī)械作用[9]，從而影響生物量的增加，所以，初步確定適合的搖床轉(zhuǎn)速為110 r/min。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)香菇液體發(fā)酵條件的影響

從圖4可以看出，在發(fā)酵的4～7 d內(nèi)，發(fā)酵液中香菇粗多糖含量逐漸增加，第7天達(dá)到最大（1.752 g/100 mL），而7～10 d內(nèi)發(fā)酵液中香菇粗多糖含量表現(xiàn)為逐步降低，這是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗得越多，菌體生長(zhǎng)受到限制[10]，所以，合適的發(fā)酵天數(shù)為7 d。

2.5 香菇液體搖瓶發(fā)酵最佳條件的確定

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，在不同的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液中香菇粗多糖的含量有所不同，正交試驗(yàn)結(jié)果表明，A1B2C2D2組合的發(fā)酵液中香菇粗多糖含量最高，為1.785 3 g/100 mL。從極差分析結(jié)果可以看出，對(duì)香菇粗多糖產(chǎn)量影響較大的因素是搖瓶轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間，所以，香菇液體發(fā)酵條件最佳組合為A1B2C2D2，即裝液量為100 mL，接種量為10%，搖瓶轉(zhuǎn)數(shù)為120 r/min，發(fā)酵時(shí)間為7 d。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為裝液量100 mL，接種量10%，搖瓶轉(zhuǎn)數(shù)為120 r/min，發(fā)酵時(shí)間7 d。此條件下發(fā)酵液中香菇粗多糖含量可達(dá)1.785 3 g/100 mL。該試驗(yàn)結(jié)果可為香菇的下一步小型罐體發(fā)酵提供相應(yīng)理論依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，對(duì)香菇液體發(fā)酵條件影響較大的因素是搖瓶轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間，其次是裝液量和接種量，當(dāng)然各種發(fā)酵條件之間是相互影響的，為了節(jié)省生產(chǎn)成本，應(yīng)該選擇生產(chǎn)周期短的發(fā)酵工藝。

［1］王相剛.蕈菌學(xué)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2010：247-270.

［2］沈維鐸，姚志偉，楊群.香菇液體培養(yǎng)的工藝優(yōu)化[J].武漢生物工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，8（2）：86-89.

［3］雷敬敷.香菇發(fā)酵工藝及香菇多糖的提取[J].中國(guó)食用菌，2011，12（3）：31-34.

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Study on Optimization of Mushrooms Liquid Fermentation Conditions

WEI Ya-dong，WANGGuang-hui，LI He，LI Yan-fang，HUPan
（College ofAgriculture and Water ConservancyEngineering，Suihua University，Suihua 152061，China）

In this study,taking size mushrooms as experimental materials,fermentation lentinan content was detection index to determine the optimum conditions of the liquid fermentation strains by the univariate test and orthogonal test.The results showed that the best fermentation conditions was liquid volume 100 mL,inoculum10%,rotation speed 120 r/min,fermentation time 7 d.Under this conditions,fermentation lentinan content was up to1.785 3 g/100 mL.

mushroom;liquid fermentation;optimization;orthogonal test

S646.1＋2

A

1002-2481（2016）04-0506-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.04.21

2015-12-29

綏化學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究資助項(xiàng)目（K1401007）

魏雅冬（1978-），女，黑龍江綏化人，講師，碩士，主要從事微生物學(xué)和食用菌的教學(xué)及研究工作。