Ghrelin在馴鹿胃腸道的表達及定位檢測

唐 娟 ， 張 曼 ， 金 鑫 ， 劉 驕 ， 田巧珍 ， 王云鶴 ， 楊銀鳳

(1.內蒙古農牧業科學院獸醫研究所， 內蒙古呼和浩特 010031； 2.內蒙古農業大學獸醫學院， 內蒙古呼和浩特 010018)

Ghrelin在馴鹿胃腸道的表達及定位檢測

唐 娟1， 張 曼2， 金 鑫2， 劉 驕2， 田巧珍2， 王云鶴2， 楊銀鳳2

(1.內蒙古農牧業科學院獸醫研究所， 內蒙古呼和浩特 010031； 2.內蒙古農業大學獸醫學院， 內蒙古呼和浩特 010018)

通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和免疫組織化學技術對Ghrelin在馴鹿胃腸道的表達及定位進行初步研究。 RT-qPCR結果顯示，Ghrelin在馴鹿胃腸道內均有表達， 且在皺胃內表達量極顯著高于其他組織(P<0.01)， 其次是十二指腸、 回腸和結腸； 免疫組織化學結果顯示， Ghrelin免疫陽性細胞在皺胃內主要分布于黏膜層、 黏膜下層和肌層； 在瘤胃、 網胃、 瓣胃的黏膜層、 黏膜下層中也可見Ghrelin的免疫陽性細胞， 但肌層中未見表達； 在十二指腸、 空腸、 回腸、 結腸的黏膜層、 黏膜下層和肌層均有Ghrelin免疫陽性細胞分布， 且在腸絨毛和黏膜下層分布較多。 RT-qPCR和免疫組織化學結果顯示，Ghrelin在胃腸道內表達量及分布范圍基本一致， 這表明Ghrelin對馴鹿的消化可能具有潛在的調控作用。

Ghrelin； 馴鹿； 實時熒光定量PCR； 免疫組織化學

Ghrelin最早是由日本學者Kojima等[1]在人和鼠的胃中分離出來的一種含有28個氨基酸殘基的多肽，是生長激素促分泌素受體1a(growth hormone secretagogue receptor 1a，GHS-R1a)的一個內源性配體。據報道，這28個氨基酸序列在魚類、鳥類、爬行動物、兩棲動物和哺乳動物體內顯著保守[2]。研究發現，Ghrelin免疫陽性細胞分布于嚙齒類動物胃腸道的各個部位。其中在胃黏膜層中分布最密集；在腸隱窩和絨毛的上皮細胞分布較多，并隨著消化管向后延伸數量大幅度減少[3]。Hayashida等[4]用免疫組織化學方法發現Ghrelin密集分布于牛、綿羊、豬、馬和大鼠胃腺的頸部至底部，特別在豬的賁門和幽門區分布較多。而關于Ghrelin在馴鹿這種野生動物身上的研究報道很少，目前相關的究研僅局限于馴鹿生長素Ghrelin全長cDNA的克隆及序列分析[5]。因此，本試驗采用RT-qPCR和免疫組織化學等方法對馴鹿胃腸道內Ghrelin的相對表達量及細胞定位進行了研究，以探索Ghrelin對馴鹿胃腸道消化的調節作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品制備 成年雄性馴鹿由內蒙古大興安嶺北敖魯古雅民族自治鄉提供。馴鹿屠宰后立即刮取瘤胃、網胃、瓣胃、皺胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸等組織黏膜，并切取適量組織塊用生理鹽水清洗后放入4%多聚甲醛固定液中4 ℃固定24 h。

1.2 相對定量

1.2.1 引物設計 根據本課題組呈送到GenBank中的馴鹿Ghrelin部分mRNA序列和跨內含子引物設計原則設計一對特異性PCR引物P1、P2。另外根據馴鹿18S rRNA序列設計另外一對PCR引物P3、P4。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

上游引物(Primer1)序列為: 5′-AACGCCCCCTTTGACATTGG-3′；

下游引物(Primer2)序列為：5′-TGAGGGTGGGGAACGGACAG -3′；

上游引物(Primer3)序列為：5′-CCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAAC-3′；

下游引物(Primer4)序列為：5′-TGATGCCCCCGACTGTCCCTATTA -3′。

1.2.2 總RNA的提取和反轉錄反應 總RNA的提取按照Total RNA提取試劑盒(TaKaRa公司日本，9108)說明書進行操作。反轉錄反應使用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)試劑盒進行操作。

1.2.3 RT-qPCR 采用SYBR Green II熒光染料進行RT-qPCR檢測，按其說明書進行操作。每個樣品的18S rRNA和Ghrelin基因分別做5個重復。由于Ghrelin和18S rRNA的擴增效率均接近等于1，因此采用2-ΔCT公式進行相對表達量的計算[6]，△Ct=CtGhrelin-Ct18S rRNA。

1.3 免疫組織化學染色 將固定好的組織樣品沖水過夜，經脫水、透明、浸蠟及包埋，制成石蠟連續切片。切片厚度為4-5 μm。按照SABC免疫組織化學試劑盒說明書進行操作，其中一抗為稀釋度1∶200的兔抗人、大鼠、小鼠、兔抗Ghrelin多克隆抗體，二抗為生物素化山羊抗兔IgG。經蘇木精復染，脫水和透明后中性樹膠封固，鏡檢。陰性對照以PBS緩沖液取代一抗，其他步驟同上。

1.4 數據統計分析 用Graphpad Prism 5軟件進行單因子方差分析，每組重復5次，檢驗結果以P<0.01 代表差異極顯著，P<0.05代表差異顯著。

2 試驗結果

2.1 Ghrelin相對表達量 RT-qPCR檢測結果經Graphpad Prism 5軟件分析發現，Ghrelin在馴鹿胃腸道內均有表達且相對表達量差異顯著(圖1)，Ghrelin在皺胃內的表達豐度極顯著高于其他器官(P<0.01)，其次是十二指腸、 回腸、結腸、瓣胃，且上述器官與瘤胃、網胃、空腸等器官內的表達量相比差異顯著(P<0.05)。

圖1 Ghrelin在馴鹿胃腸道的相對表達量**：P <0.01；*：P <0.05

2.2 Ghrelin陽性細胞的分布 經免疫組織化學染色結果顯示，Ghrelin免疫陽性細胞主要分布于瘤胃、網胃、瓣胃的黏膜層和黏膜下層，染色呈淡棕色，肌層未見陽性染色(見中插彩版圖2：A1、B1、C1)；在皺胃內大多散在分布于黏膜上皮和腺頸部，少數分布于腺體部和腺底部，黏膜下層和肌層也可見較強的陽性信號(見中插彩版圖2：D1、D2)；在十二指腸內Ghrelin的陽性細胞在黏膜層、黏膜下層和肌層均有分布(見中插彩版圖3：E1)，其中腸絨毛上皮和黏膜下層陽性染色呈深棕色，十二指腸腸腺著色不明顯(見中插彩版圖3：E2)；空腸內的Ghrelin陽性細胞主要集中在黏膜層和黏膜下層，固有層腸腺和肌層著色不明顯(見中插彩版圖3：F1)；回腸主要分布在黏膜層、黏膜下層和肌層，固有層腸腺著色不明顯(見中插彩版圖3：G1)；結腸則主要位于黏膜上皮，其次是黏膜下層，肌層未見陽性表達(見中插彩版圖3：H1)。上述各陰性對照組均未發現陽性信號(見中插彩版圖2、圖3：A3-H3)。

3 討論

Ghrelin 是生長激素領域里的一個重要發現。它的發現使我們對生長激素調節系統和胃腸功能等調節機制有了更深入的了解。目前，關于反芻動物消化道Ghrelin的研究也在持續增多。Wang等[7]通過檢測0～56日齡羔羊胃腸道內Ghrelin的表達，結果顯示，在皺胃內Ghrelin的表達量遠高于其他胃腸組織。王家鄉等[8]通過RT-PCR法研究Ghrelin在非洲雛鴕鳥胃腸道內的分布變化，結果顯示，Ghrelin除在空腸、結腸不表達外，在消化道的其他部位均有表達。本試驗采用RT-qPCR和免疫組織化學等方法對Ghrelin在馴鹿胃腸道的表達及分布進行了檢測。結果發現，皺胃、十二指腸、回腸、結腸內Ghrelin的表達量和免疫陽性細胞分布均顯著高于瘤胃、網胃、瓣胃、空腸(P<0.05)，且在馴鹿胃腸道的黏膜層、黏膜下層都可見免疫陽性反應。

于高水等[9]研究，Ghrelin在撒能奶山羊胃腸道的分布與表達，結果發現，Ghrelin陽性細胞在胃腸道黏膜層均可被檢測到。本試驗證實，在馴鹿體內Ghrelin免疫陽性細胞分布于整個消化管的黏膜層，說明反芻動物在表達Ghrelin上可能存在種屬特異性。本試驗還發現，在瘤胃、網胃、瓣胃內Ghrelin mRNA和蛋白表達均比較低。Ghrelin陽性細胞在馴鹿皺胃、十二指腸、空腸、回腸的分布特點與黑麂[10]、濟寧青山羊[11]和鼠[12]相一致，黏膜層、黏膜下層和肌層都可見免疫陽性細胞的分布，提示Ghrelin可能對馴鹿胃腸功能和胃酸的分泌發揮調節作用。

[1] Kojima M, Hosoda H, Date Y,etal. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach[J]. Nature, 1999, 402 (6762): 656-660.

[2] Kaiya H, Miyazato M, Kangawa K,etal. Ghrelin: a multifunctional hormone in non-mammalian vertebrates[J]. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2008, 149:109-128.

[3] Sakata I, Tanaka T, Matsubara M,etal. Postnatal changes in ghrelin mRNA expression and in ghrelin-producing cells in the rat stomach[J]. Endocrinol, 2002, 174:463-471.

[4] Hayashida T, Murakami K, Mogi K,etal. Ghrelin in domestic animals: distribution in stomach and its possible role[J]. Domest Anim Endocrinol, 2001, 21(1):17-24.

[5] 楊銀鳳, 余興邦, 王冠玉. 中國馴鹿生長素Ghrelin全長cDNA的克隆及序列分析[J]. 中國獸醫學報, 2014, 34(1): 1647-1652.

[6] Shao Y J, Liu SH Q, Tang X Y,etal. Ontogeny of ghrelin mRNA expression and identification of ghrelin immu-nopositive cells in the gastrointestinal tract of the Peking duck, Anas platyrhychos[J].Gene Comp Endocrinol, 2010, 166: 12-18.

[7] Wang W, Cheng L, Guo J,etal. Expression of Ghrelin in gastrointestinal tract and the effect of early weaning on Ghrelin expression in lambs[J]. MoBiol Rep, 2014, 4(2): 909-914.

[8] Wang J X, Li P, Peng K M,etal. cDNA cloning of ghrelin and ontogeny of ghrelin mRNA expression in the gastrointestinal tract of African ostrich chicks[J]. Regul Pept, 2011, 167:50-55.

[9] 于高水, 張文龍, 黃勇, 等. Ghrelin在撒能奶山羊胃腸道內的分布與表達[C].北京：獸醫病學會論文集, 2012：45(7): 156-157.

[10] 蔣書東, 戴書俊, 方富貴, 等. 黑麂肝、小腸和大腸的組織學結構及Ghrelin 的分布[J]. 動物學雜志, 2012, 47(1): 36 -43.

[11] 張德敏. 濟寧青山羊胃腸道Ghrelin免疫陽性細胞與小腸組織結構的發育性變化[D]. 泰安: 山東農業大學, 2012.

[12] Dass N B, Munonyara M, Bassil A K,etal. Growth hormone secretagogue receptors in rat and human gastrointestinal tract and the effects of Ghrelin[J]. Neuroscience, 2003, 120(2): 443-453.

The examination of expression andlocalization of Ghrelin in the reindeer gastrointestinal tract

TANG Juan1, ZHANG Man2, JIN Xin2, LIU Jiao2, TIAN Qiao-zhen2,WANG Yun-he2, YANG Yin-feng2

(1. Academy of Agriculture and Animal Husbandry in Inner Mongolia, Hohhot 010031， China;2. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agriculture University, Hohhot 010018,China)

The RT-qPCR and Immunohistochemistry were used to examine the expression and localization of Ghrelin in the reindeer gastrointestinal tract. The results of RT-qPCR indicated that the expression in the abomasum was significantly higher than that in other organs(P<0.01), followed by duodenum, ileum and colon. Immunohistochemical staining results showed that Ghrelin-positive cells in the abomasum were mainly distributed in the tunica mucosa, tunica submucosa and tunica muscularis and also detected in the tunica mucosa, tunica submucosa of rumen, reticulum, omasum. Ghrelin-positive cells were mainly localized in the tunica mucosa, tunica submucosa and tunica muscularis of duodenum, jejumum, ileum, and colon. Especially more cells were found in the epithelium of intestinal villi and the tunica submucosa. RT-qPCR and immunohistochemistry indicated that Ghrelin was presented in gastrointestinal tract, suggesting its possible role in regulating the digestive function.

Ghrelin; reindeer; RT-qPCR; Immunohistochemistry

YANG Yin-feng

2016-06-29

內蒙古自然科學基金(2013MS0408)

唐娟(1965- )，女，副研究員，本科，主要從事中獸藥的研發,E-mail:tangjuan12002@163.com；張曼(1990- )，女，博士生，主要從事動物解剖及分子生物研究，E-mail：zhangman90514@163.com

楊銀鳳，E-mail：julie1963@163.com

S865.4?2

A

0529-6005(2016)11-0040-03

注：張曼與唐娟對本文具有同等貢獻