血漿對氧磷酶1在奶牛酮病中的變化及其預測作用

曹 宇 ， 張 江 ， 楊 威 ， 夏 成 ， 張洪友 ， 王艷輝 ， 徐 闖

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院， 黑龍江大慶163319)

血漿對氧磷酶1在奶牛酮病中的變化及其預測作用

曹 宇 ， 張 江 ， 楊 威 ， 夏 成 ， 張洪友 ， 王艷輝 ， 徐 闖

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院， 黑龍江大慶163319)

為了早期預測奶牛酮病的發生， 隨機選取黑龍江某集約化牛場， 產后14～21 d奶牛為試驗動物。 通過對氧磷酶1(PON1)、 葡萄糖(GLU)、 游離脂肪酸(NEFA)、 β-羥丁酸(BHBA)和谷草轉氨酶(AST)的檢測， 闡明奶牛圍產期PON1在奶牛酮病發生風險的預警作用。 結果表明， 酮病組較對照組奶牛血漿中PON1活性和含量顯著下降。 PON1含量、 活性與GLU、 BHBA、 NEFA和AST均有顯著相關性。 根據受試者工作特征曲線(ROC)分析確定酮病預測值為血漿PON1含量>46.79 nmol/L、 GLU>3.04 mmol/L、 AST<100 U/L、 NEFA>0.82 mmol/L。 試驗表明，PON1、 GLU、 AST和NEFA均可用作預測奶牛酮病發生風險的評估指標。

奶牛； 酮?。?對氧磷酶-1； 相關分析； ROC分析

酮病是奶牛圍產期常見的危害較為嚴重的營養代謝病，其臨床主要表現為酮血癥、酮尿癥和酮乳癥[1]。國際上公認的奶牛酮病診斷的金標準是血漿β-羥丁酸(BHBA)≥1.2 mmol/L[2]。較多文獻還報道了奶牛酮病、肝功異常與奶牛脂肪肝發生密切相關。當奶牛酮病圍產期發生率越高、血漿BHBA濃度升高越多(2.50 mmol/L以上)，肝功酶活性越高(AST>100 U/L)，奶牛脂肪肝發生率也越高[3]。

PON1是一種鈣依賴性酶，主要經肝臟分泌入血。最新的文獻報道血中PON1活性降低對奶牛脂肪肝具有良好的診斷價值[4]。本試驗通過檢測圍產后期酮病奶牛和AST高的試驗牛血漿中PON1活性和含量以及相關生化指標，闡明血漿PON1對產后酮病發生風險的預測作用，為及早預防奶牛酮病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與血液樣本采集 在黑龍江某地采用自由臥欄、TMR飼喂以及具有完善牛場管理軟件的集約化奶牛場中開展試驗。選取年齡2～4歲，胎次1～3次，產后14～21d健康奶牛21頭，酮病奶牛17頭。

試驗奶牛于清晨采血時間點空腹進行尾靜脈采血10 mL，加入150 IU肝素抗凝，于30 min內離心分離血漿(5 000 r/min離心5 min)，血漿分裝后置于 -80 ℃ 冰柜冷凍保存。

1.2 檢測指標與統計分析 血漿PON1活性使用血液PON1有機磷酸酶活性光度法定量檢測試劑盒檢測，PON1含量使用牛PON1酶聯免疫分析測定(均購自上海哈靈科技有限公司)。β-羥丁酸、游離脂肪酸、谷草轉氨酶和血糖(以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所)。

試驗數據使用IBM SPSS 19.0軟件進行統計分析，各組試驗數據進行獨立樣本t檢驗分析，相關性利用皮爾遜相關系數分析，疾病預測利用二元回歸分析，診斷效果以及分界值的確定利用ROC分析。

2 結果

2.1 試驗奶牛血液生化指標的比較 由表1可知，酮病組較對照組奶牛血漿中PON1活性顯著下降；PON1含量和GLU含量極顯著下降；AST、BHBA和NEFA含量極顯著升高。

表1 試驗奶牛血液生化指標的比較

2.2 奶牛PON1與血液各生化指標的相關性 由表2可知PON1含量與PON1活性和葡萄糖呈極顯著正相關；與AST呈顯著負相關；與BHBA和NEFA呈極顯著負相關。PON1活性與PON1含量和GLU呈極顯著正相關；與AST和BHBA呈極顯著負相關。

表2 奶牛PON1與血液各生化指標的相關性

*：差異顯著， P<0.05； **差異極顯著,P<0.01

3 泌乳奶牛酮病的風險預測

表2和中插彩版圖1顯示了奶牛酮病預警的相關指標分界值、敏感度和特異性。通過Youden指數確定的最佳分界值分別為血漿PON1含量>46.79 nmol/L，GLU>3.04 mmol/L，AST<100 U/L，NEFA<0.82 mmol/L；敏感度分別為87.50%、93.80%、100%和75%，特異度分別為100%、83.3%、82.4%、94.1%。曲線下面積分別為0.953、0.929、0.941和0.894。

表3 分界值、敏感度、特異度陰性預測值、陽性預測值、陽性依然比、陰性依然比和ROC曲線下面積

4 討論

本研究顯示，酮病組奶牛血中PON1活性和含量較正常組均顯著降低，并與BHBA呈顯著負相關。這可能是圍產期奶牛由于能量輸出較大而得不到充分的能量補給而引起奶牛處于能量負平衡狀態，體脂動員產生大量的脂肪酸在肝臟肝線粒體和內質網β氧化過程中會產生大量的活性氧(ROS)[5]。過多的ROS和自由基耗竭抗氧化因子，使促氧化物與抗氧化物之間的動態平衡失調，導致脂質過氧化，就容易導致氧化應激狀態[6]。脂質過氧化物可產生大量具有反應活性和細胞毒性的中間產物，導致肝細胞死亡、壞死，并通過細胞損傷產生炎癥反應或吸引炎癥細胞浸潤肝實質[7]。當肝臟損傷時，肝臟合成PON1減少，血中PON1活性會下降。這可能與機體氧化應激與PON1活性成反比有關[8]。另外，NEFA本身就具有肝細胞毒性，通過增強腫瘤壞死因子等細胞因子的毒性，引起線粒體腫脹與通透性增加、肝細胞變性、壞死或凋亡[9]。本試驗NEFA與PON1含量呈顯著負相關，這與以往的研究一致，PON1可能對奶牛脂肪肝具有一定的診斷作用[4]。同時，血中AST活性卻顯著的升高，PON1與AST存在顯著的負相關。這是由于AST存在于多種器官的細胞的胞漿或線粒體內且尤以肝臟、心肌和骨骼肌中活性最高。當肝細胞受損時，細胞膜通透性增加，胞漿中酶釋放入血，血中酶活性會升高。因此，AST常作為肝脂沉積的標志物來診斷脂肪肝[10]。

本試驗初步對奶牛酮病相關指標進行了預測，結果顯示，PON1含量應高于46.79 nmol/L；GLU高于3.04 mmol/L；AST不應高于100 U/ml；NEFA不應高于0.82 mmol/L，試驗表明，PON1、GLU、AST和NEFA均可用作預測奶牛酮病發生風險的評估指標。

[1] 石冬梅, 周德忠. 動物普通病防治[M]. 2版. 北京：中國農業大學出版社，2011．

[2] Padilla L, Shibano K, Inoue J,etal. Plasma vitamin C concentration is not related to the incidence of ketosis in dairy cows during the early lactation period[J]. Journal of veterinary medical science, 2005, 67(9): 883-886.

[3] Xu C, Wang Z. Comparative proteomic analysis of livers from ketotic cows[J]. Veterinary research communications, 2008, 32(3): 263-273.

[4] Farid A S, Honkawa K, Fath E M,etal. Serum paraoxonase-1 as biomarker for improved diagnosis of fatty liver in dairy cows[J]. BMC veterinary research, 2013, 9(1): 1.

[5] Videla L A. Energy metabolism, thyroid calorigenesis, and oxidative stress: Functional and cytotoxic consequences[J]. Redox Report，2000,5:265-275.

[6] Bouwstra R, Goselink R, Dobbelaar P,etal. The relationship between oxidative damage and vitamin E concentration in blood, milk, and liver tissue from vitamin E supplemented and nonsupplemented periparturient heifers[J]. Journal of dairy science,2008, 91(3): 977-987.

[7] AdamsL A, Lindor K D. Nonal coholic fatty liver disease [J]. AnnEpi-demiol, 2007, 17: 863-869.

[8] Aviram M, Rosenblat M. Paraoxonases 1, 2, and 3, oxidative stress, and macrophage foam cell formation during atherosclerosis development[J]. Free Radic Biol Med,2004,37:1304-1316.

[9] 曾民德. 脂肪肝發病機制及其“二次打擊”假設[J]. 中華消化雜志, 2002, 03:35-36.

[10] Seifi H A, Gorji-Dooz M, Mohri, M,etal. Variations of energy-related biochemical metabolites during transition period in dairy cows[J]. Comparative Clinical Pathology, 2007,16(4): 253-258.

Warning Value of Plasma PON1 in Dairy Cows with Ketosis

CAO Yu, ZHANG Jiang, YANG Wei, XIA Cheng, ZHANG Hong-you, WANG Yan-hui, XU Chuang

(Collge of Animal Science and Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319，China)

In order to predict early cow ketosis,postpartum dairy cows were randomly selected as experimental animals in Heilongjiang.Biochemical assay was used to determine PON1, GLU, NEFA, BHBA and AST to clarify the role of PON1 in the risk of ketosis in dairy cows. Results indicated that PON1 activity and level of PON1 were significantly decreased when compared with the control group(P<0.05). The activity of serum PON1 and level of PON1 were significantly correlated with the level of plasma GLU, AST and BHBA. According to the receiver operating characteristic curve (ROC) analysis, the ketosis warning values of plasma PON-1 content is more than 46.79 nmol/L, GLU is more than 3.04 mmol/L, AST is less then 100 U/L and NEFA is less than 0.82 mmol/L.This study verifv that the levels of PON1, GLU, AST and NEFA could be used as indicators to predict the risk of ketosis for dairy cows.

Dairy cow; Ketosis; PON-1; Correlation Analysis; Receiver Operating Characteristic

ZHANG Hong-you

2016-03-16.

國家科技部計劃項目(2012BAD12B05-2；2012BAD12B03-2；2013BAD21B01)；霍英東教育基金會高等院校青年教師基金(141021)

曹宇(1991- )，男，碩士生，研究方向為臨床獸醫學，E-mail：1015009909@qq.com

張洪友，E-mail: zhy478@163.com

S823.91

A

0529-6005(2016)11-0038-02