牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)持續(xù)感染牛的篩查與胚胎移植

唐 燕 ， 孟小林 ， 賈林軍 ， 劉曉娜 ， 李 桉 ， 范洪先

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 新疆昌吉831100 ； 2.新疆豪子畜牧業(yè)有限公司， 新疆奇臺831800)

牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)持續(xù)感染牛的篩查與胚胎移植

唐 燕1， 孟小林1， 賈林軍1， 劉曉娜1， 李 桉1， 范洪先2

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 新疆昌吉831100 ； 2.新疆豪子畜牧業(yè)有限公司， 新疆奇臺831800)

為了保證胚胎移植的效果， 達(dá)到良種繁育的目的， 對胚胎移植的受體牛進(jìn)行了牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)-持續(xù)感染(PI)牛的篩查。 首先采取受體牛血清樣本， 然后提取樣本RNA， 反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 進(jìn)行RT-巢式PCR， 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果， 確定受體牛是否是BVDV-PI牛。 初次檢測結(jié)果為陰性的牛， 可作為胚胎移植的備選牛。 初檢陽性的牛， 進(jìn)行隔離， 3周后進(jìn)行復(fù)檢， 連續(xù)進(jìn)行兩次復(fù)檢， 如果3次檢測結(jié)果都為陽性， 認(rèn)定該牛為BVDV-PI牛， 予以淘汰。 如果復(fù)檢為陰性， 則判為BVDV急性感染牛， 可繼續(xù)使用。 結(jié)果108頭受體牛中， 確認(rèn)3頭受體牛為BVDV-PI牛， 予以淘汰， BVDV-PI牛陽性率2.8%。 剩下的105頭受體牛， 通過直腸檢查可用于胚胎移植的81頭。 45天后孕檢， 懷孕61頭， 受胎率75.3%。

BVDV-PI牛篩查 ； RT-巢式PCR ； 胚胎移植 ； 受胎率

在過去50多年里，通過嚴(yán)格的基因篩選，奶牛牛奶產(chǎn)量有了大幅增長。但是在高產(chǎn)奶牛，盡管有大量的獸醫(yī)工作者參與其中，奶牛的繁殖率下降一直困擾著牛場[1]。牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是一種牛生殖系統(tǒng)病原體，它可降低牛受胎率，引起流產(chǎn)，產(chǎn)生持續(xù)感染牛(Persistent infection，PI)[2-3]。BVDV-PI牛一般是母牛懷孕早期感染非細(xì)胞病變型(noncytopathic，NCP)BVDV后，NCP BVDV突破胎盤屏障感染胎兒后形成的。有些BVDV-PI牛沒有臨床癥狀，但其血液中含有107TCID50/mL BVDV[4]，可以排毒，成為傳染源造成疫病流行。因此，防范懷孕母牛接觸BVDV，是防止BVDV-PI牛產(chǎn)生的根本。另外，BVDV還可引起受精失敗或早期胚胎死亡，進(jìn)而導(dǎo)致反復(fù)配種[5]。

胚胎移植(ET)技術(shù)是提高家畜生產(chǎn)性能和縮短育種進(jìn)程的有效途徑，胚胎冷凍保存和移植技術(shù)在推動畜牧業(yè)發(fā)展和加快優(yōu)良品種發(fā)揮著越來越重要的作用，近幾年來被廣泛應(yīng)用于牛的生產(chǎn)。新疆昌吉州某牛場，為了進(jìn)行良種繁育，決定進(jìn)行胚胎移植。牛場進(jìn)行了“兩病”檢疫工作，但從未進(jìn)行過BVDV篩查工作，根據(jù)文獻(xiàn)報道，新疆地區(qū)BVDV最高抗體陽性率均在90%以上，部分奶牛場犢牛死亡率達(dá)45%[6]，從這些數(shù)據(jù)可看出，新疆地區(qū)BVDV感染非常普遍，而且嚴(yán)重的影響了新疆養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。牛場進(jìn)行此病的篩查十分有必要，尤其是進(jìn)行良種繁育的牛場。本試驗采用美國高產(chǎn)荷斯坦奶牛體內(nèi)法生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)冷凍胚胎，采用直接移植法，移植后代母牛建立高產(chǎn)奶牛核心群，公牛進(jìn)入公牛站，進(jìn)行后裔測定。受體牛為15月齡以上的荷斯坦青年母牛。

1 材料

1.1 試驗動物 受體牛為15月齡以上荷斯坦青年母牛108頭，膘情中、上等，體況評分3.0以上。“兩病”檢疫為陰性，從未免疫豬瘟疫苗或牛病毒性腹瀉疫苗。TMR全混飼喂，3次/d。

1.2 樣本信息 108頭受體母牛的血清樣本。

1.3 胚胎來源 美國高產(chǎn)荷斯坦奶牛體內(nèi)法生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)冷凍胚胎。

1.4 試劑、藥品及耗材 超純RNA 提取試劑盒、cDNA第一條鏈合成試劑盒、DNA Marker(天根生化科技(北京)有限公司)；鹽酸利多卡因注射液(晉城海斯制藥有限公司)；氯前列烯醇鈉注射液(丹東市綠丹和華動物藥有限公司,0.2 mg/支)；注射用促性腺激素釋放激素(蘇州市蘇牧動物藥業(yè)有限公司,100 μg/支)；胚胎移植槍、塑料硬外套、無菌軟外套、長手套(法國卡蘇)；獸用RX一次性采血盛血器(衡州市榮欣醫(yī)療器材有限公司)。

1.5 儀器設(shè)備 50s TRINGA VET便攜式獸用B超儀(PIEMEDICAL)；PCR儀(eppendorf)；Molecular Imager ? Gel DocTMXR+ system凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2 試驗方法

2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的BVDV 5'UTR保守區(qū)域基因序列設(shè)計引物。首先應(yīng)用 Primer 5.0軟件設(shè)計引物，然后將設(shè)計的引物進(jìn)行Blast比對，以確定所用引物的特異性，最后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體引物序列見表1。

表1 巢式PCR引物

2.2 RT-巢式PCR

2.2.1 RNA 提取與 cDNA 合成 按照超純RNA 提取試劑盒，cDNA 第一條鏈合成試劑盒的說明書提取受體牛血清樣本中的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，進(jìn)行后續(xù)巢式PCR。

2.2.2 巢式PCR 以樣本cDNA作為模板，引物 F1/F2 進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后， 取第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，分別以引物P1/P2、 P3/P4 進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，然后取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、分析樣本的BVDV感染情況。具體PCR體系見表2，PCR 程序設(shè)定為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。巢式PCR陽性對照模板為：BVDV Oreron C24V接種MDBK后，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄的cDNA；陰性對照模板為：ddH2O。

初次檢測結(jié)果為陰性的牛，可作為胚胎移植的備選牛。檢測結(jié)果為陽性的牛，進(jìn)行隔離，3周后再次采取血清，進(jìn)行復(fù)檢，連續(xù)進(jìn)行兩次復(fù)檢。如果復(fù)檢結(jié)果仍為陽性，該牛確定為BVDV-PI牛，予以淘汰。如果復(fù)檢為陰性，則判為BVDV急性感染牛，可繼續(xù)使用。

表2 PCR體系

2.3 胚胎移植

2.3.1 發(fā)情觀察及催情處理 全群荷斯坦受體牛每天觀察發(fā)情，計入發(fā)情記錄，然后對照繁殖記錄看月齡是否達(dá)到15月齡。移植前直腸檢查時，觀察體重是否達(dá)到成年體重的70%。定期對月齡、體重達(dá)標(biāo)，但不見發(fā)情的青年受體牛進(jìn)行直腸檢查，使用氯前列烯醇(PGF2a)、促性腺激素釋放激素(Gnrh)進(jìn)行催情處理。

2.3.2 胚胎移植 受體牛發(fā)情第1天作為0 d，第7天做胚胎移植，通過直腸檢查卵巢及子宮狀況，卵巢上有直徑大于1.0 cm以上的功能性黃體的受體牛進(jìn)行移植，胚胎解凍，胚胎從液氮中取出后在空氣中停留10 s，然后32 ℃水浴15 s，取出用潔凈衛(wèi)生紙擦干管壁，剪去封口端1 cm，裝入移植槍移植，受體牛外陰部清洗消毒，做鎮(zhèn)靜處理和硬膜外鞘麻醉，將胚胎移植于受體牛子宮黃體側(cè)，移植部位是有功能性黃體一側(cè)子宮角深部。移植操作中避免損傷子宮內(nèi)膜。移植結(jié)束45 d直腸檢查結(jié)合B超，根據(jù)子宮變化確認(rèn)妊娠狀況。

3 結(jié)果

3.1 通過分析RT-巢式PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，108頭受體牛中，初檢97頭牛呈陰性，可用于胚胎移植；另有11頭牛血清樣本，經(jīng) P1/P2引物擴(kuò)增到了195 bp大小的片段 ，而經(jīng)P3/P4引物擴(kuò)增所有受體牛血清樣本均為陰性,這11頭牛進(jìn)行隔離，BVDV感染率為10.2%。3周后復(fù)檢這11頭牛，8頭牛轉(zhuǎn)為陰性，可作為后續(xù)胚胎移植的備選牛；3頭牛呈BVDV陽性，3周后復(fù)檢第2次，3頭牛仍為BVDV陽性，確認(rèn)這3頭牛為BVDV-PI牛，予以淘汰，BVDV-PI牛陽性率2.8%。部分檢測結(jié)果見圖1。

圖1 RT-F巢式PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

M：DNA Markers 600； 1:陽性對照BVDV Oreron C24V； 2～6:樣本DNA； 7:陰性對照ddH2O

3.2 除去BVDV-PI牛，剩下的105頭受體牛，通過直腸檢查確定有81頭牛可用于胚胎移植,胚胎移植45 d后直腸檢查結(jié)合B超進(jìn)行孕檢，懷孕61頭，受胎率75.3%。

4 討論

4.1 胚胎移植前，進(jìn)行BVDV-PI牛篩查，凈化了牛群，在良好的胚胎移植操作基礎(chǔ)上，可提高移植的受胎率，同時也保證了懷孕母牛及犢牛的健康，真正做到良種繁育。根據(jù)BVDV篩查結(jié)果，可知道受體牛感染的是BVDV I型。

4.2 技術(shù)人員的熟練程度對胚胎移植受胎率有很大的影響。非手術(shù)移植時，胚胎移植的部位以及移植時是否引起子宮損傷，是影響牛胚胎移植受胎率高低的主要因素之一，因此準(zhǔn)確的判斷黃體和子宮環(huán)境，將胚胎放到子宮的恰當(dāng)位置至關(guān)重要。首先，移植前檢查受體牛卵巢是否有功能性黃體存在。其次，一定要用利多卡因尾椎硬膜外鞘麻醉，松弛子宮平滑肌，便于后續(xù)移植操作。最后，移植時，握移植槍的手只要輕微帶一點勁，主要靠直腸內(nèi)的手操作，使移植槍穿過子宮頸。移植槍進(jìn)子宮角后直腸內(nèi)的手要把移植槍頭所在位置的子宮角拿直，使之與移植槍在一條直線上，移植槍隨之前移，如此反復(fù)操作，使移植槍到達(dá)子宮角深部，最終進(jìn)到子宮角再也拿不起來的位置為止。

4.3 此次胚胎移植，凍胚解凍后，沒有進(jìn)行胚胎形態(tài)觀察，依然取得了好的移植效果，說明胚胎移植時，只要移植操作規(guī)范，凍胚質(zhì)量高，解凍后可直接進(jìn)行胚胎移植。

在胚胎移植前，進(jìn)行BVDV-PI牛的篩查，不但可以減少移植后受胎率降低或流產(chǎn)率上升等不良事件的發(fā)生，也可以保證懷孕母牛及后代的健康，使牛場的良種繁育真正走向健康發(fā)展的道路。當(dāng)前商業(yè)性胚胎移植的水平，非手術(shù)移植，凍胚移植受胎率平均為50%[7]。而此次胚胎移植的受胎率達(dá)75.3%，提示胚胎移植前，進(jìn)行BVDV的篩查，有助于提高胚胎移植的受胎率。

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[4] Brock K V, Grooms D L, Ridpath J,etal. Changes in levels of viremia in cattle persistently infected with bovine viral diarrhea virus[J]. J Vet Diagn Invest,1998,10:22-26.

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[7] 李捷鑫，劉夢鶴,楊佳棟,等.奶牛高效繁殖技術(shù)應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2015(23):77-79.

BVDV persistently infectedcows screening and embryo transfer

TANG Yan1, MENG Xiao-lin1, JIA Lin-jun1, LIU Xiao-na1, LI An1, FAN Hong-xian2

(1.Xinjiang Agricultural Vocational Technical College, Changji 831100, China;2. Xinjiang Haozi Animal Husbandry Co. Ltd, Qitai 831800, China)

In order to ensure the effect of embryo transfer and improve breeding, recipient cows were screened to determine whether they are BVDV-PI cattle. First, recipient cows serum samples were collected, and then RNA was extracted, and used for BVDV analysis by RT-nested PCR. If the first test result of the recipient cows is negative, they can be used as an alternative cow for embryo transfer. Early detection of positive cows were isolated and rechecked after three weeks, and were then rechecked twice in a row. If the three test results were positive, the cow was identified as BVDV-PI cattle, and was eliminated. If the recheck was negative, the cow could be judged as an acute BVDV infection， and could be used. Three cows from 108 recipient cows were identified as BVDV-PI cattle, and were eliminated. BVDV-PI cattle positive rate of 2.8%. The remaining 105 recipient cows could be used for embryo transfer. And then, 81 cows were confirmed to be used for embyo transfer by rectal examination. After 45 days, pregnancy 61 were examined to be pregnant, and then pregnancy rate was 75.3%.

BVDV-PI cattle screening; RT-nested PCR;embryo transfer; pregnancy rate

FAN Hong-xian

2016-08-05

新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研基金項目(XJNZYKJ-2014002)

唐燕(1974- )，女，講師，博士生，研究方向為疾病模型實驗動物學(xué)，E-mail:1074086262@qq.com

范洪先，E-mail: 645969195@qq.com

S857.2+1

A

0529-6005(2016)11-0029-03