動物RNA病毒檢測關鍵試劑—反轉錄酶(M-MLV RTase)的制備

牛建蕊 ， 高志強 ， 蒲 靜 ， 張 偉， 劉 環 ， 劉文曉 ， 張鶴曉

(1. 北京森康生物技術開發有限公司, 北京懷柔101400 ； 2. 北京出入境檢驗檢疫局， 北京朝陽100026)

動物RNA病毒檢測關鍵試劑—反轉錄酶(M-MLV RTase)的制備

牛建蕊1， 高志強2， 蒲 靜2， 張 偉2， 劉 環2， 劉文曉1， 張鶴曉2

(1. 北京森康生物技術開發有限公司, 北京懷柔101400 ； 2. 北京出入境檢驗檢疫局， 北京朝陽100026)

反轉錄酶是動物RNA病毒分子診斷用到的關鍵試劑之一。 為獲得純度高、 活性高、 制備簡單經濟的M-MLV RTase， 本試驗將M-MLV RTase的基因序列進行密碼子優化， 合成并構建表達載體。 將表達載體轉化到大腸桿菌E.coliRosetta宿主菌種， 經IPTG誘導后實現M-MLV RTase的可溶性表達。 利用Ni2+柱親和層析純化載有6xHis標記的重組M-MLV RTase， 對重組酶進行Western Blotting試驗， 鑒定為M-MLV RTase。 通過對動物流感病毒RNA的普通RT-PCR和熒光RT-PCR檢測來評價重組酶的活性并估測其活性單位。 將活性單位相當的重組酶和商品酶進行比較， 結果顯示，制備的重組酶活性高， 對不同濃度病毒RNA的檢測結果與商品酶相當。 研制的M-MLV RTase可以用于動物RNA病毒的分子診斷。

M-MLV RTase； 表達； 純化； RT-PCR

動物疫病診斷和檢測不外乎兩大類方法，一是針對血清中抗體的血清學檢測方法，一是針對病原體的病原學檢測方法?？贵w檢測可以評估使用疫苗后的情況，以及判斷是否曾經感染過某種動物疫病，病原學檢測是確定動物攜帶病原體直接證據的方法。病原體分離的優點是結果準確，是病原診斷檢測的金標方法，缺點是耗時長，需要幾天甚至幾周才能出結果，而且還伴隨生物安全問題，需要一定生物安全級別的實驗室才能進行。

隨著分子診斷技術的出現，病原學診斷檢測技術得到突飛猛進的發展，病原學診斷檢測技術已經達到一個新的高度，不再單單依靠病原分離就能對動物疫病做出準確診斷。動物RNA病毒檢測目前應用最廣的技術為RT-PCR技術、熒光RT-PCR技術、核酸等溫擴增技術等，不論哪種分子診斷技術，都用到關鍵試劑-反轉錄酶。反轉錄酶又稱依賴RNA 的DNA 聚合酶，常見的反轉錄酶主要有M-MLV RTase和AMV RTase。由于反轉錄酶質量參差不齊，不同品牌的反轉錄酶效果不一，同一品牌的反轉錄酶不同批次效果也不同，導致組裝的試劑盒質量受到影響。

為保證動物RNA病毒的檢測質量，保證檢測結果的準確性，本研究表達純化M-MLV RTase，并對其進行活性評價，以便更好地完善動物RNA病毒分子診斷檢測，保證研發的試劑盒的質量。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體E.coliRosetta，購自TaKaRa公司；pET-21b，購自Novagen公司。

1.2 主要試劑 商品酶M-MLV RTase，購自Promega公司；Ni-NTA His·Bind樹脂，購自美國QIAGEN；抗His標簽單抗，購自Novagen公司和Thermo公司；離心超濾管，購自 Millipore公司。

1.3 目標序列的優化、合成及表達載體的構建 對從NCBI下載的M-MLV RTase基因序列[1]進行利于其在大腸桿菌中可溶性表達的密碼子優化后，委托深圳華大基因科技服務有限公司合成并連接到pET-21b載體中，獲得重組表達載體pET-21b-MMLV-RT，轉化到E.coliRosetta，用于表達。

1.4 重組蛋白的可溶性表達 挑取含有pET-21b-MMLV-RT單菌落接種到5 mL含有100 μg/mL Amp的LB液體培養基，37 ℃ 過夜培養獲得母液，按照2%接種量接種到500 mL 上述培養基中，37 ℃振蕩培養至OD600在0.2～0.8之間，然后根據不同的培養時間、IPTG濃度以及誘導時間等參數進行表達，摸索最佳誘導條件。

1.5 重組蛋白的純化與鑒定[2-3]

1.5.1 親和層析 收集誘導表達的重組菌體，超聲破碎、離心，將獲得可溶性蛋白上清經0.45 μm濾膜過濾。按說明書進行親和層析純化，收集流出液、漂洗液及洗脫液。

1.5.2 超濾 使用Amicon Ultra-15 mL離心超濾管對純化后的蛋白進行超濾，達到濃縮和置換蛋白保存液的目的。

1.5.3 Western Blotting檢測 利用抗His的單抗對帶有His標簽的重組蛋白進行Western Blotting檢測，以鑒定重組蛋白表達。

1.6 活性檢測 用動物A型流感病毒M基因的一對引物來擴增流感病毒M基因，并將獲得的目的片段進行序列比對，通過普通RT-PCR檢驗制備重組酶的活性。用重組M-MLV RTase取代動物A型流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒的反轉錄酶，通過熒光RT-PCR來檢測重組酶的活性。通過對重組酶與商品酶的熒光RT-PCR擴增對比，來估算重組酶的活性單位。

1.7 靈敏度比較 將相當活性的重組M-MLV RTase與商品酶分別對10倍倍比稀釋的動物A型流感病毒RNA進行普通RT-PCR與熒光RT-PCR檢測，評價重組酶的檢測靈敏度。

2 結果

2.1 重組 M-MLV RTase的誘導表達、純化與鑒定 最終表達菌在OD600為0.5，加入終濃度0.4 mmol/L的 IPTG，25 ℃低溫誘導12 h的條件下獲得可溶性的重組蛋白，圖1箭頭為上清表達的目的蛋白。重組蛋白的純化結果見圖2，圖中泳道4到7為4次洗脫后收集到目的蛋白。對目的蛋白進行超濾，最終獲得10 mL保存在保存緩沖液中的蛋白液，結果見圖3。Western Blotting的鑒定結果見圖4，出現了大小在75 kD左右的目的條帶。

圖1 重組蛋白的可溶性誘導表達

圖2 重組蛋白的純化梯度咪唑漂洗

M:Marker; 1:穿過液； 2～3: 20 mmol/L咪唑洗滌液； 4～7:250 mmol/L咪唑洗脫液

圖3 重組蛋白的超濾

1:超濾前； 2:超濾后; M:Marker

圖4 重組蛋白Western-Blotting鑒定

2.2 重組 M-MLV RTase的RT-PCR活性檢測

2.2.1 普通RT-PCR 重組酶及商品酶通過普通RT-PCR均能擴增出目的片段，將目的片段送測，測得序列與模板序列比對均100%同源，說明重組酶具有反轉錄酶活性。

2.2.2 熒光RT-PCR 中插彩版圖5可見，制備的重組酶與商品酶均能獲得熒光RT-PCR擴增曲線。為測定重組酶活性單位，以相同量的商品酶作為對照，將倍比稀釋后的重組酶進行熒光RT-PCR。結果見中插彩版圖6，由于重組酶加入量過高時，會抑制Taq DNA聚合酶的活性[4]，導致擴增曲線低，隨著稀釋倍數的增加，重組酶的擴增曲線逐漸升高，說明我們未稀釋或稀釋度所加酶量都可能超過了最佳用量；但當稀釋過高時，酶濃度過低，所以擴增曲線下降，Ct值也開始升高。中插彩版圖6中1為0.5 μL(200 U/μL)商品酶的擴增曲線，Ct值為20.10；4為0.5 μL 4倍稀釋重組酶的PCR擴增曲線，Ct值為20.42，這兩個酶的擴增效果相當，由此可知制得重組酶4倍稀釋后至少每微升有200 U的酶活，與商品酶活性相當。

2.3 重組M-MLV RTase與商品酶的靈敏度比較 在普通RT-PCR檢測中，相當活性單位的重組酶與商品酶均可檢測到稀釋到10-4的動物A型流感病毒RNA，但重組酶擴增條帶的亮度略高；在熒光RT-PCR檢測中，相當活性單位的重組酶和商品酶均可檢測到10-6稀釋度的病毒RNA，但重組酶的擴增曲線要高于商品酶，結果見中插彩版圖7。

3 討論

已有報道重組M-MLV RTase在大腸桿菌的表達，但表達量低、純化步驟復雜[5-6-7]。針對上述問題，我們首先通過對目標序列密碼子優化和誘導條件摸索解決了可溶性表達量低的問題。再利用重組蛋白上的His標簽進行純化，通過超濾濃縮，減少酶活性的損失，解決純化復雜，酶活性降低的問題。試驗表明，本研究構建的重組表達載體可溶性表達量高、易純化。

通過對動物病毒RNA的普通RT-PCR和熒光RT-PCR檢測，驗證了重組M-MLV RTase的反轉錄活性。熒光RT-PCR試驗發現重組酶濃度過高時，會出現抑制反應的現象，在普通RT-PCR檢測中不明顯，說明制得的酶濃度高。為獲得相同活性單位的重組酶進行下游比較試驗，我們對重組酶進行倍比稀釋后與商品酶對比估測重組酶的活性單位，經過反復試驗制得活性單位為200 U/μL的重組酶。將活性單位相同的重組酶與商品酶對不同稀釋倍數的動物A型流感病毒RNA進行檢測，評價重組酶的靈敏度，結果顯示，重組酶與商品酶的靈敏度相當，對低濃度的病毒RNA均可檢出。

動物RNA病毒分子診斷及檢測的關鍵試劑-反轉錄酶的質量是影響結果準確性的關鍵因素。目前市場銷售的商品酶，價格高，保質期短，不能滿足動物疫病病原熒光RT-PCR檢測試劑盒的需求，因為為了解決這一技術難題，我們進行了反轉錄酶的制備技術研究，結果顯示，本制備技術操作簡單、耗時短、產量高，獲得的重組酶活性高、靈敏度高、穩定性好，可用于動物病原分子診斷，適于大量推廣。

[1] Georgiadis M M, Jessen S M, Ogata C M,etal. Mechanistic implications from the structure of a catalytic fragment of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase[J].Structure， 1995，3：879-892．

[2] Mirza M R, Rainer M, Messner C B,etal. A new type of metal chelate affinity chromatography using trivalent lanthanide ions for phosphopeptide enrichment[J]. Analyst，2013，138：2995-3004．

[3] Petty K J. Metal-chelate affinity chromatography[J]. Curr Protoc Protein Sci，2001，Chapter 9：4-9．

[4] Sellner L N, Coelen R J, Mackenzie J S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity[J]. Nucleic Acids Res，1992，20：1487-1490．

[5] Kotewicz M L, D'Alessio J M, Driftmier K M,etal.Cloning and overexpression of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase in Escherichia coli[J].Gene，1985，35：249-258．

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[7] Chen Y, Xu W, Sun Q. A novel and simple method for high-level production of reverse transcriptase from Moloney murine leukemia virus (MMLV-RT) in Escherichia coli[J]. Biotechnol Lett，2009，31(7)：1051-1057．

Preparations of the M-MLV RTase as the key reagent for the detection of animal RNA viruses

NIU Jian-rui1, GAO Zhi-qiang2, PU Jing2, ZHANG Wei2, LIU Huan2, LIU Wen-xiao1, ZHANG He-xiao2

(1. Beijing Senkang Biotech Development Co., Ltd, Beijing 101400, China；2. Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026， China)

Reverse Transcriptase was used as one of the key reagents for Animal RNA virus molecular diagnosis. In order to obtain high purity, high activity, economy and easy preparation of M-MLV RTase, the codons of the sequence of M-MLV RTase were optimized, and the expression vector was constructed and transformed into E.coli Rosetta which was induced by IPTG. Soluble M-MLV RTase expression was achieved, and the M-MLV RTase with a tag of 6 x His was purified by Ni2+affinity chromatograph and identified through Western blotting. The activity and activity unit of the recombinant enzyme were evaluated through the detection of animal influenza virus by ordinary RT-PCR and real time RT-PCR. Compared to commercial Enzyme, the recombinant M-MLV RTase has the same efficasy in testing the influenza virus in different dilutions. The recombinant M-MLV RTase can be used in the diagnosis of animal RNA viruses.

M-MLV RTase; expression; purification; RT-PCR

ZHANG He-xiao

2015-11-12

國家質檢總局科技計劃項目(2014IK232)

牛建蕊(1983- )，女，博士，主要從事動物疫病檢測技術研究，E-mail：jrniu@126.com

張鶴曉，E-mail:aqlzhx@126.com

S852.65+93

A

0529-6005(2016)11-0026-03