云南師宗和江蘇盱眙中華按蚊的分子鑒定及COII基因序列分析

胡 騎 ， 王靜林 ， 何于雯 ， 孫 強 ， 吳 晶

(云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室云南省畜牧獸醫科學院， 云南昆明650224)

云南師宗和江蘇盱眙中華按蚊的分子鑒定及COII基因序列分析

胡 騎 ， 王靜林 ， 何于雯 ， 孫 強 ， 吳 晶

(云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室云南省畜牧獸醫科學院， 云南昆明650224)

為了了解云南省師宗縣和江蘇省盱眙縣中華按蚊的分子鑒定及COII基因序列特征， 2014年7月在云南省師宗縣和江蘇省盱眙縣采集蚊蟲標本， 通過形態學鑒定出中華按蚊， 再提取蚊蟲基因組DNA， 用COII基因特異引物和序列測定， 然后采用生物信息學軟件進行核苷酸序列同源性和遺傳進化分析。 結果在云南省師宗縣縣城周圍采集蚊蟲標本314只， 其中按蚊234只(74.52%)；在江蘇省盱眙縣桂五鎮采集蚊蟲標本212只， 其中按蚊143只(67.45%)。 經形態學鑒定， 每個地方挑選了8只疑似中華按蚊進行序列分析， 結果顯示，16只蚊蟲COII核苷酸序列同源性在98%-100%之間， 遺傳進化分析顯示，16只蚊蟲全部與中華按蚊位于同一進化分支內。 表明了采用分子鑒定的方法可有效地進行蚊蟲種類鑒定。

中華按蚊 COII基因 分子鑒定

中華按蚊(An.sinensis)是按蚊中分布最廣且最常見的種類之一；它偏嗜動物血液，外棲或半外棲，種群數量大，是我國以往文獻記載中瘧疾和絲蟲病的重要傳播媒介，對人類和家畜動物危害極大[1-2]。但與其他按蚊形態學上非常相似，用傳統形態分類的方法很難對這些蚊蟲進行準確鑒定[2]。因此，本文對采集的中華按蚊進行分子鑒定以及COII基因序列分析，從分子水平了解采集的蚊蟲標本與中華按蚊的遺傳進化關系，為研究我國蚊蟲分子分類提供資料，這對預防和控制以中華按蚊為傳播媒介的疾病發生和傳播具有重要的科學意義。

1 材料與方法

1.1 標本采集 2014年7月在云南省師宗縣縣城周圍和江蘇省盱眙縣桂五鎮農戶家牛圈采用誘蚊燈(功夫小帥，12 V; 300 mA; 湖北武漢)進行標本采集，采集時間段約為晚間18:00至次日早晨8:00共14 h。次日早晨收集標本，將標本置于-20℃冰箱中冷凍20～30min，待存活的蚊蟲剛好冷凍死亡后，取出標本根據蚊蟲形態學特征采用解剖鏡進行蚊蟲形態學鑒定，將形態學鑒定為按蚊的蚊蟲標本放入70%乙醇中保存。

1.2 蚊蟲DNA提取及PCR擴增 從乙醇中取出按蚊標本，在解剖顯微鏡下分離頭胸部及腹部，腹部用DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)按說明書提取蚊蟲DNA，操作步驟如下：每只按蚊標本用緩沖液GA 200 μL，充分研磨，加20 μL Proteinase K，56 ℃溫浴過夜，加200 μL緩沖液GB混勻，70 ℃放置10 min。加200 μL無水乙醇充分混勻15 min，過柱，分別用500 μL緩沖液GD和 600 μL 漂洗液PW洗滌，加 60 μL 洗脫緩沖液TE洗脫DNA。取2 μL cDNA做反應模板，用COII特異引物[3]進行PCR擴增，依次加入10XBuffer 5 μL、2.5mmol /ld NTP 5 μL、上下游引物各1.25 μL、rTaq酶0.75 μL、去離子水31.75 μL，充分混勻，94 ℃預變性5 min，94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃60 s，35個循環，72 ℃延伸10 min，1%瓊脂糖電泳檢查擴增條帶，用TaKaRa DNA fragment Purification Kit純化PCR擴增產物，PCR擴增產物由昆明碩科公司進行測序。

1.3 序列分析 使用Clustal X Version 2.1 軟件包進行病毒基因核苷酸序列比對，DNASTAR 軟件中MegAlign進行核苷酸序列同源性分析。使用MEGA5.05 軟件完成基于Neighbor-joining (NJ) 方法的進化樹繪制，bootstrap值為1 000。

1.4 使用日本奧林巴斯SZX-7解剖顯微鏡及明美顯微數碼成像系統對按蚊的頭胸部進行照相，用于形態學鑒定。

2 結果

2.1 蚊蟲采集 2014年7月在云南省師宗縣縣城周圍采集蚊蟲標本314只，在江蘇省盱眙縣桂五鎮采集蚊蟲標本212只，共526只。經形態學鑒定，云南省師宗縣采集按蚊234只(74.52%)，庫蚊23只(7.32%)，阿蚊45只(14.33%)，其他蚊蟲12只(3.82%)；江蘇省盱眙縣桂五鎮采集按蚊為143只(67.45%)，庫蚊45只(21.23%)，阿蚊13只(6.13%)，其他蚊蟲11只(5.19%)。表明在云南省師宗縣和江蘇省盱眙縣，按蚊都是7月份的優勢種類。

2.2 核苷酸序列同源性分析 從云南師宗縣的蚊蟲樣品中取8只形態學鑒定為疑似中華按蚊的樣品，標記為YN-SZ-1至YN-SZ-8(均為雌性，5只飽血，3只未吸血)；從江蘇省盱眙縣的蚊蟲樣品中取8只形態學鑒定為疑似中華按蚊的樣品，標記為JS-1至JS-8(均為雌性，6只飽血，2只未吸血)。進行DNA提取和COII基因PCR擴增，總共16只蚊蟲標本擴增均為陽性，經序列測定獲得約740個核苷酸序列。16只按蚊的核苷酸序列同源性在98.4%至100%之間。總共16只中華按蚊與GenBank中的巨大按蚊，岡比亞按蚊，微小按蚊，中華按蚊，多斑按蚊和八代按蚊的相應序列進行分析(見表1)。所有的16只按蚊與中華按蚊的核苷酸序列同源性最高，在98.8%-100%之間，與巨大按蚊的核苷酸序列同源性最低，在78.62-80%之間，與岡比亞按蚊、微小按蚊、多斑按蚊的核苷酸序列同源性均低于90% ，與八代按蚊的核苷酸序列同源性在在 94.73%-95.93%之間。

表1 云南省師宗縣和江蘇省盱眙縣按蚊的COII基因核苷酸序列同源性分析

圖1 云南省師宗縣和江蘇省盱眙縣采集中華按蚊COII基因(600nt)遺傳進化分析

2.3 遺傳進化分析 對兩地采集的共16只蚊蟲與GenBank中4條中華按蚊序列、2條八代按蚊序列、1條岡比亞按蚊序列、6條微小按蚊序列、3條多斑按蚊序列及1條巨大按蚊序列共6個種，17條按蚊序列一起構建系統進化樹，見圖1。結果顯示，不同的按蚊種均形成較大的分支，與核苷酸序列同源性分析結果一致；云南省師宗縣采集的8只蚊蟲標本和江蘇省盱眙縣采集的8只蚊蟲標本均位于中華按蚊分支內，與其他種的按蚊分支有明顯區別，表示云南省師宗縣采集的8只蚊蟲標本和江蘇省盱眙縣采集的8只蚊蟲標本均為中華按蚊。

2.4 形態學分析 雌蚊下顎有白環；翅前緣有明顯的亞緣脈白斑和亞端白斑,基段可雜有少數淡色鱗，符合中華按蚊的形態學特征。

圖2 江蘇省盱眙縣和云南省師宗縣的中華按蚊形態學

3 討論

DNA序列分析是鑒定生物體不同種、亞種和地理株，以及研究其系統進化關系的方法之一[4]。近年來，一些國內外學者采用線粒體基因COI、COII、COIII和ITS基因序列以及其他一些基因作為分子靶標進行蚊蟲種類鑒定，其中線粒體基因COII進化速率適中，在能夠保證足夠變異的同時又很容易被通用引物擴增[5-6]。本試驗采用COII基因作為分子靶標對云南省師宗縣和江蘇省盱眙縣采集到的蚊蟲標本進行分子鑒定，結果顯示，16只形態學鑒定為中華按蚊的標本，在系統進化樹上全部與中華按蚊位于同一進化簇，核苷酸序列同源性均在98%以上，符合蚊蟲COII基因種內判定值98%以上[7]的要求。而其他進化簇的核苷酸序列同源性均低于96%，因此可確定這16只蚊蟲標本均為中華按蚊。

大多數從事動物傳染病病原研究的科研人員并沒有良好的昆蟲學背景，而蚊蟲的種類極多，屬內蚊蟲在形態學上容易混淆產生錯誤，對不太熟練的科研人員尤其如此。因此本次研究中先進行形態學分類，剔除不同屬的蚊蟲以及容易辨別的蚊蟲，再進行分子鑒定和遺傳進化關系的研究，既提高了工作效率，也避免了形態學對相近蚊蟲種類的錯誤分類，從分子水平較好明確這些蚊蟲分類，為人和動物蚊傳疾病的傳播控制提供科學依據。

云南省曲靖市師宗縣和江蘇省淮安市盱眙縣，地理位置相距2 000 km，海拔高差1 500 m以上，氣候環境相差巨大，但兩地的蚊蟲在7月份都是按蚊占絕對優勢(67%)以上，且兩地的中華按蚊在核苷酸序列同源性和系統發育上并沒有明顯區別。兩地的按蚊在種類分布、核苷酸序列同源性和系統發育方面的區別有待進一步研究。

[1] 雅軍，瞿逢伊，徐建農，等.我國中華按蚊群體分子遺傳多態研究[J]. 昆蟲學報， 2001, 07(2):56-58.

[2] Wang J,Zhang H，Sun X,etal.Distribution of mosquitoes and mosquito-borne arboviruses in Yunnan Province near the China-Myanmar-Laos border [J].Am J Trop Med Hyg， 2011,84(5):738-746.

[3] Flomer O，Black M. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates [J]. Mol Mar Bio and Bio, 1994, 3: 294-299.

[4] 黃朝暉，王金福. 三種蚊蟲COIl基因的克隆與序列分析[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2001,19(2):90-92.

[5] 王剛. 基于 DNA 條形碼基礎上的我國主要蚊蟲分子分類系統的建立[D]. 北京：中國人民解放軍軍事醫學科學院，2011.

[6] Monaghan M T,Balke M,Gregory T R,etal.DNA-based species delineation in tropical beetles using mitochondrial and nuclear markers [J]. Phil Trams R Soc B, 2005, 360: 1925-1933.

Molecular Identification and COII gene analysis of Anopheles sinensis from Shizong County, Yunnan Province and Xuyi County, Jiangsu Province

HU Qi, WANG Jing-lin, HE Yu-wen, SUN Qiang, WU Jing

(Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Disease Laboratory Animal Science and Veterinary Institute，kunming 650224,China)

To understand the molecular taxonomy ofAn.sinensisand the characteristics of COII gene in Shizong County, Yunnan Province and Xuyi County, Jiangsu Province. In July 2014, we collected insects from Shizong County, Yunnan Province and Xuyi County, Jiangsu Province. We first identifiedAn.sinensisby insect morphology. And then the genome DNA of mosquitos were extracted and amplified by COII gene specific primers and sequenced, which were analyzed by bioinformatics software for nucleotide sequence homology and phylogenetic relationships.We collected 314 insects from Shizong County, Yunnan Province, including 234Anopheles(74.52%, and 212 insects from Xuyi County, Jiangsu Province, including 143Anopheles(67.45%). We identified them by morphology, and then selected 8 suspectedAn.sinensisfrom each of the two places for sequencing analysis. Results showed that the nucleotide sequence homology of all 16 insects COII genes varied from 98%-100%, and the phylogenetic analysis showed that all 16 insects andAn.sinensislocated in the same cluster. Molecular identification method is a very effective way to identify mosquito species.

An.sinensis; COII gene; Molecular Identification

WANG Jing-lin

2016-05-03

云南省科技計劃青年項目(2014FD075)

胡騎(1980- )，男，助理研究員，碩士，從事動物傳染病原研究，E-mail：ynkmhq999@163.com

王靜林，E-mail：Wangjl107@163.com

S855

A

0529-6005(2016)11-0020-03