中哈邊境阿拉山口口岸輸入性亞洲璃眼蜱的種類鑒定與分析

徐 軍 ， 王安東 ， 戴 莉 ， 楊 杰 ， 羅 丹 ，徐建軍 ， 李志遠 ， 熱依罕古麗 ， 薩尼葉古麗

(1.新疆出入境檢驗檢疫局 ， 新疆烏魯木齊832000 ； 2.石河子大學動物科技學院 ， 新疆石河子832000 ；3.阿拉山口出入境檢驗檢疫局 ， 新疆阿拉山口833418 ； 4.石河子大學醫學院 ， 新疆石河子832000 ；5.新疆農業大學動物醫學學院 ， 新疆烏魯木齊830052)

中哈邊境阿拉山口口岸輸入性亞洲璃眼蜱的種類鑒定與分析

徐 軍1， 王安東2， 戴 莉3， 楊 杰3， 羅 丹4，徐建軍5， 李志遠2， 熱依罕古麗5， 薩尼葉古麗5

(1.新疆出入境檢驗檢疫局 ， 新疆烏魯木齊832000 ； 2.石河子大學動物科技學院 ， 新疆石河子832000 ；3.阿拉山口出入境檢驗檢疫局 ， 新疆阿拉山口833418 ； 4.石河子大學醫學院 ， 新疆石河子832000 ；5.新疆農業大學動物醫學學院 ， 新疆烏魯木齊830052)

對1批從哈薩克斯坦進口羊毛中檢獲的蜱樣品進行種類鑒定。應用16S rDNA基因和COI基因兩條DNA條形碼技術進行鑒定分析。結果16S rDNA序列分析顯示與新疆亞洲璃眼蜱(KC203351)同源性最接近(99%)；COI基因序列分析顯示與新疆伊犁亞洲璃眼蜱(KF527440)同源性最接近(99%)。結論：經DNA條形碼比對，確定為亞洲璃眼蜱，應加強對外來醫學媒介生物防控，嚴防“外來病”入侵。

亞洲璃眼蜱 ； 種類鑒定 ； 16S RNA ； COI ； 線粒體 ； 阿拉山口口岸

羊毛和毛皮是紡織服裝和毛皮行業的重要生產原料，我國毛紡織工業和毛皮行業快速發展，國內羊毛和毛皮原料供不應求，每年需從國際市場購進大量羊毛和毛皮。羊毛夾帶是檢疫監管中老大難問題。有文獻顯示，羊毛能攜帶炭疽、小反芻獸疫、布魯菌等動物傳染病的病原體、媒介生物和植物種子等[1]。利用傳統方法分析蜱種的系統進化具有很大局限性，尤其體現在以下情況：形態學特征很相似的物種、標本破壞、缺乏未成蜱的性狀描述或采集的標本為飽血個體。隨著研究技術的飛速發展，DNA 條形碼技術為物種鑒定、種群研究及系統進化分析提供了有效途徑[2]。本研究嘗試使用DNA 條形碼技術，對入境羊毛夾帶的殘缺蜱進行種類鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料 2015 年從哈薩克斯坦進境的一批羊毛夾帶中檢出一批蜱，共23只，樣本損壞嚴重，無法鏡檢。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取 按照TIANamp Genomic DNA Kit 說明書，進行DNA 提取(1只/份)，將提取的DNA置于-20 ℃保存備用。

1.2.2 PCR擴增 根據張璘[2]，Rees D J[3]已經報道的16S rDNA、COI 序列進行PCR。引物序列及其相應擴增條件見表1。50 μL PCR 反應體系包含如下成分：25 μL 2×TaqPCR Master Mix，1 μL 10 mmol/L 上游引物，1 μL 10 mmol/L 下游引物，2 μL DNA模板，21 μL ddH2O。

表1 引物及其反應條件

1.2.3 序列分析及分子遺傳進化分析 將PCR產物送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，測序結果與GenBank中進行Blast進行同源性分析，然后使用Mega6.0軟件進行遺傳進化分析，構建分子系統進化樹。

2 結果

2.1 PCR擴增結果 通過PCR擴增上述23只蜱樣本線粒體DNA，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均獲得特異性很好的PCR產物，與預期目的片段一致(圖1)。

圖1 蜱16S rDNA和COI PCR電泳結果

M：DNA Marker ；左1～3：蜱樣本16S rDNA PCR產物；右1～3：蜱樣本COI PCR產物

2.2 DNA條形碼技術分析 經測序，16Sr DNA基因測得21條序列，COI基因測得21條序列。DNAMAN分析顯示，16S RNA和COI基因序列之間存在多樣性，16S rDNA可以獲得6個不同序列(KU183532-KU183537)，COI可以獲得17個不同序列(KU364317-KU364334)。經Blast分析，所有蜱樣本均與亞洲璃眼蜱同源性最高。其中，16Sr DNA序列顯示與新疆亞洲璃眼蜱(KC203351)同源性最接近(99%)；COI基因序列顯示與新疆尉犁亞洲璃眼蜱(KF527440)同源性最接近(99%)。從分子系統發育樹最大似然分析可知，16Sr DNA基因序列與亞洲璃眼蜱(KC203351，新疆)(KP400549，新疆阿拉山口)(KF527439，新疆尉犁)(JX051092，內蒙古)聚為一支，COI基因序列與亞洲璃眼蜱(KF527440，新疆尉犁)(JQ737073，甘肅)(JQ737070，新疆)(JX051141，內蒙古)(KF583578，新疆)聚為一支。

3 討論

隨著分子生物學的發展，蜱的分子分類學鑒定開始應用并發展起來[4-5]在蜱類物種鑒定和系統研究中起了非常重要的作，用。16S rDNA是動物線粒體較保守的基因，進化速率緩慢，以替換為主，可用保守引物或通用引物定位并進行PCR擴增；COI基因是線粒體蛋白編碼基因之一，可以自由變異，且COI的演化速率是其他蛋白編碼基因的3倍，有足夠的變異能夠將物種區別開來，COI 還具有較少的插入和缺失，兩端序列有相對的保守性的特點，是較好的分子標記[2]。本研究通過使用16SrDNA和COI兩條DNA條形碼，成功對從哈薩克斯坦輸入性亞洲璃眼蜱進行分子鑒定，對加強口岸醫學媒介的查驗和監測有較大的指導意義。由此可見：DNA條形碼能夠準確、快速地鑒定外來蜱種，為口岸地區蜱類鑒定提供新思路。

2008年阿拉山口出入境檢驗檢疫局在3批哈薩克斯坦國進口的牛皮中連續亞洲璃眼蜱、殘緣璃眼蜱和盾糙璃眼蜱[6]，本次在哈薩克斯坦進口羊毛夾帶中檢出亞洲璃眼蜱。因此，硬蜱在阿拉山口口岸進口動物產品中具有較高的輸入風險。亞洲璃眼蜱主要生活在荒漠或半荒漠地區，通常寄生于駱駝，牛，馬，羊等家畜以及刺猬，野兔等，也侵襲人。哈薩克斯坦地處歐亞大陸中部，共有4個自然帶：森林草原帶、草原帶、沙漠帶和半沙漠帶[7]，哈薩克斯坦自然環境與我國新疆十分相似。加之亞洲璃眼蜱是新疆出血熱病原體的攜帶者，此外，該蜱還能自然感染Q熱，北亞蜱媒斑點熱、蜱媒腦炎等，并是牛環形泰勒蟲的傳播媒介[8]。Tumanova IIu在 2001-2003年對哈薩克斯坦和塔吉克斯坦的亞洲璃眼蜱、小亞璃眼蜱和銀盾革蜱中克里米亞-剛果出血熱病毒監測中首次發現哈薩克斯坦存在非洲樣的克里米亞-剛果出血熱病毒[9]。因此，一旦活亞洲璃眼蜱隨動物產品輸入新疆，將會定居繁殖，并對新疆當地人和家畜造成危害。

阿拉山口作為“一路一帶”向西開放的橋頭堡，國外大量牛、羊、皮毛從口岸借助交通工具攜帶媒介生物入境，增加了蟲媒病傳入我國的風險。因此應加強對口岸地區媒介生物的檢測，同時加強對入境易染動物及其產品的監督監測，嚴格消毒，嚴防“外來病”的入侵。

[1] 顧志軍，徐金祥，沈濤，等.進境羊毛有害生物防控及監管措施探討[J].檢驗檢疫科學，2008(1)：56-58.

[2] 張璘.新疆北疆地區蜱種分布及蜱源性病原檢測方法的建立[D].石河子：石河子大學，2014：47-48.

[3] Rees D J，Dioli M，Kirkendall L R.Molecules and morphology：evidence forcryptichybridization in African Hyalomma(Acari：Ixodidae)[J].Mol PhylogenetEvo，2003，27(1)：131-142.

[4] Zahler M，Filippova N A，Morel P C，etal.Relationships between species of the Rhipicephalus sanguineus group：A molecular appmach[J].J Parasitol，1997，83(2)：302-306．

[5] Dobson S J，Barker S C.Phylogeny of the hard ticks(Ixedidae)inferred from 18S rRNA indicates that the genus Aponommais paraphyletic[J].Mol Phylogenet Evol，1999，11(2)：288-295.

[6] 尹小平，葉志輝，嬌娃，等.阿拉山口口岸地區蜱類區系調查及宿主動物染帶關系監測分析[J].中國媒介生物學及控制雜志，2010，21(4)：375-377.

[7] 中華人民共和國駐哈薩克斯坦共和國大使館經濟商務參贊處.哈薩克斯坦的農業和畜牧業[EB/OL].[2004-03-19].

[8] 劉繼榮，米來，王平福，等.準噶爾盆地硬蜱區系考察與名錄記述[J].中國動物傳染病學報，2013，21(1)：60-65.

[9] Tumanova IIu，Seregin S V，Vyshemirskii O I，etal.Genetic monitoring of the Crimean-Congo Hemorrhagic Fever virus in Kazakhstan and Tajikistan in 2001-2003[J].Mol Gen Mikrobiol Virusol，2006(2)：36-41.

Species identification of an imported tick sample ofHyalommaasiaticumasiaticum by genetic analysis at Alashankou port，China- Kazakhstan border

XU Jun1， WANG An-dong2， DAI Li3， YANG Jie3， LUO Dan4，XU Jian-jun4， LI Zhi-yuan2， RE Yi-han-gu-li5， SA Ni-ye-gu-li5

(1.Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Urumqi 830000，China ；2.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000，China ； 3.Alashankou Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Alashankou 833418，China ； 4.College of Veterinary Medicine，Shihezi University，Shihezi 830052，China ；5.College of Veterinary Medicine ， XND ， Urumqi 830052，China)

To identify the species of ticks in wool samples from Kazakhstan at Alashankou port，Xinjiang Uygur Autonomous Region，China.The 16S rDNA and CO1 identification were carried out for the ticks，and sequence analysis was performed to establish the molecular phylogenetic tree.The 16S rDNA and COI were clustered together withHyalommaasiaticumasiaticum(accessionnumbers：KC203351，KF527440)；these strains had the highest homology withHyalommaasiaticumasiaticum(99%).Based on DNA barcode comparison，the imported tick sample was identified asHyalommaasiaticumasiaticum. We should strengthen the prevention and control of imported medical vectors，to prevent the "Exotic Diseases".

Hyalommaasiaticumasiaticuma； Speciesi dentification ； 16S rDNA ； COI gene ； Alashankou Port ； China-Kazakhstan border

2015-11-05

新疆維吾爾自治區自然科學基金(201442137-1)；國家質檢總局科技計劃項目(2014IK239)；公益性行業(農業)科研專項(201103008)

徐軍(1969-)，男，高級獸醫師，碩士，從事動物檢驗工作，E-mail：alskxj@sina.com

王安東(1990-)，男，碩士生，從事獸醫衛生監督與管理研究工作，E-mail：wadshzu@163.com

Q969

A

0529-6005(2016)11-0017-02

注：王安東與徐軍對本文具有同等貢獻