禽IL-2單克隆抗體的制備與鑒定

付夢姣 ， 王永強 ， 曹 紅 ， 李曉齊 ， 鄭世軍

(中國農業大學動物醫學院農業生物技術國家重點實驗室 ， 北京海淀100193)

禽IL-2單克隆抗體的制備與鑒定

付夢姣 ， 王永強 ， 曹 紅 ， 李曉齊 ， 鄭世軍

(中國農業大學動物醫學院農業生物技術國家重點實驗室 ， 北京海淀100193)

為制備禽源IL-2的單克隆抗體，首先構建chIL-2的原核表達載體并進行表達，用HIS-IL-2蛋白免疫BALB/c小鼠，經3次免疫后，取小鼠脾與骨髓瘤細胞sp2/0 融合，應用間接ELISA 方法篩選陽性雜交瘤，最終獲得3 株穩定分泌chIL-2 抗體的雜交瘤，分別命名為1C2，2F2和4B5。并對所獲得單抗的特性進行了鑒定，結果表明，3株單抗亞型均為IgG1，抗體親和力解離常數(Kd)分別為4.81×10-10、1.36×10-10、4.15×10-9，均為高親和力抗體，經過Western Blot 確定3株單抗分別識別chIL-2的不同區域，且均能特異性識別chIL-2。該單抗的制備為chIL-2的功能研究和應用奠定了基礎。

禽源IL-2 ； 原核表達 ； 單克隆抗體

IL-2(Interleukin-2)主要是由T細胞產生的具有重要免疫調節作用的細胞因子。1976 年Morgan 等[1]發現小鼠脾細胞培養上清液中有一種能夠促進和維持T 細胞在體外長期生長的因子，將其稱為T 細胞生長因子(T cell growth factor，TCGF)，1979 年統一命名為IL-2，1983 年Taniguchi等[2]從ConA 刺激的Jurkat T 細胞系中首次成功克隆出人IL-2 基因并成功表達，此后多種哺乳動物及反芻動物的IL-2 基因被相繼成功克隆出來[3]。1997 年，Sundick 等[4]用ConA 激活的雞脾淋巴細胞構建了一個cDNA 文庫，獲得了雞IL-2 基因。Hilton 等[5]的研究表明，作為第一個非哺乳動物IL-2 基因克隆，雞IL-2 表現了與哺乳動物相似的生物學活性。由于雞IL-2 與哺乳動物的IL-2差異較大，且具有很強的種屬特異性[6-7]，使許多可在哺乳動物中成功應用的技術和方法都無法有效地應用于雞IL-2 的研究，本研究通過制備雞IL-2單克隆抗體，為深入研究雞IL-2的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種、質粒、蛋白、細胞及實驗動物 大腸桿菌E.coliBL21、Rosetta、DH5α，骨髓瘤細胞sp2/0，質粒pGEX-6p-1、pET-28a 為本實驗室保存，標簽蛋白His-IL-10、His-IFN-γ、His-IFN-β為本實驗室保存。BALB/c 小鼠，購自中國醫學科學院實驗動物研究所。

1.2 主要試劑與儀器設備 限制性內切酶、LATaq酶和DNA 連接酶，購自TaKaRa 公司。dNTPs，購自CNS 公司；DNA 膠回收試劑盒，購自ZYMO RESEARCH 公司；高純度質粒小量快速提取試劑盒，購自北京艾德萊公司；Ni-NTA 親和純化柱，購自德國Qiagen 公司；Glutathione Sephrose 4B 凝膠，購自GE Healthcare BioSciences AB 公司；鼠源His-tag與GST-tag 單克隆抗體，購自Abmart 公司；HRP 標記山羊抗小鼠IgG 二抗，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；DMEM高糖培養基，購自Gibco公司；標準胎牛血清，購自Hyclone 公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT 和鼠單抗亞型分型試劑，均購自Sigma 公司。PEG 4000，購自MERCK 公司；Centrifuge5810R 型低溫冷凍高速離心機，購自Eppendorf 公司；Alpha ImagerTM2200 型凝膠成像分析儀，購自美國Alpha 公司；KoDak 醫學X 光顯影機102 型，購自美國KoDak 公司；Sunrise型96 孔酶標儀，購自TECAN 公司。

1.3 chIL-2 原核表達載體構建及蛋白純化 取感染球蟲的雞脾淋巴細胞，提取其總mRNA 進行反轉錄，以反轉得到的cDNA 為模板，根據NCBI上發布的禽源IL-2 的序列(NO.AM231331.1)設計引物：F,5′-ATGATGTGCAAAGTACTGATCTTT-3′；R,5′-TTATTTTTGCAGATATCTCAC-3′，將擴增得到的特異性條帶回收后連接至T 載體，轉化至DH5α，以測序正確的載體為模板，用含有酶切位點BamHI 和EcoRI 的特異性引物(F,5′-CGCGGATCCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTT-3′；R,5′-CCGGAATTCTTATTTTTGCAGATATATAAC-3′)將chIL-2 擴增出來，雙酶切后連接到酶切過的pET-28a 和pGEX-6p-1 載體上，轉化入DH5α，通過菌落PCR 檢測并將雙酶切鑒定的陽性樣本進行測序，測序正確者即載體構建成功。

將構建成功的質粒pET-28a-chIL-2與pGEX-6p-1-chIL-2分別轉化工程菌，進行誘導表達。通過SDS-PAGE分析蛋白表達情況并用Western Blot進行驗證。確定蛋白表達之后進行大量誘導表達，通過包涵體復性或親和層析的方法對所獲得蛋白進行純化，純化后的蛋白分別用作免疫小鼠和陽性雜交瘤篩選抗原。

1.4 chIL-2單克隆抗體的制備 小鼠經過3次免疫后，以ELISA方法測定chIL-2陽性血清效價，效價合格者用于細胞融合。小鼠免疫程序參照文獻[8]進行，細胞融合、陽性雜交瘤篩選參照文獻[9]。腹水的制備及單抗的純化按照文獻[10]所述方法進行。

1.5 chIL-2單克隆抗體的鑒定

1.5.1 單體Ig 亞類鑒定 單抗亞類的鑒定按照Sigma 公司的鼠單抗亞型分型試劑鑒定試劑盒說明書進行。

1.5.2 單抗親和力的測定 應用間接ELISA 法，以1 μg/mL 的濃度用GST-chIL-2 包被酶標板，封閉后加入倍比稀釋的純化單抗進行孵育，以HRP標記的山羊抗小鼠IgG 為二抗，酶標儀讀取OD450nm 吸光值。連續幾個稀釋度的OD450nm 讀數不再增大時視為抗原抗體100%結合，以抗體濃度(mol/L)為橫坐標，OD450nm 吸光值為縱坐標做散點圖，以讀數最大值一半時抗原抗體結合率為50%，生成對數趨勢線和公式。將OD450nm 最大值的一半代入公式，求出此時的抗體濃度即為親和力解離常數(Kd)。

1.5.3 單抗腹水效價測定 制備前1 周，按照500 μL/只向小鼠腹腔內注射石蠟，雜交瘤擴大培養后，每只小鼠按照106個細胞數腹腔注射200 μL 雜交瘤細胞懸液，6 d 后，小鼠腹圍明顯增大，采集腹水，用間接ELISA法測定腹水效價。

1.5.4 單抗特異性鑒定 分別用原核表達的His-chIL-2、His-chIL-10、His-chIFN-γ 以及His-chIFN-β進行單抗特異性的鑒定，將不同蛋白稀釋一定倍數后進行Western Blot，分別用稀釋的單抗(1∶5 000)或His 單抗(1∶10 000)作為一抗，檢測所得單抗對常見的不同細胞因子的交叉反應。

1.5.5 Western Blot分析單抗識別抗原表位 ChIL-2 全長132 個氨基酸，其N 端有一段大小為11 個氨基酸的信號肽區域[11]，故首先構建了帶有HIS 標簽的成熟的chIL-2，共121 個氨基酸，然后分別從其C 端和N 端以40 個氨基酸為單位進行截短，命名為Δ1、Δ2。用稀釋的單抗作為一抗進行Western Blot檢測，確定各株單抗的識別區域。

2 結果

2.1 原核表達載體構建及蛋白純化 從雞的脾淋巴細胞中成功克隆出432 bp 大小的chIL-2 基因，與預期一致(見圖1A)。經BamHI、EcoRI 雙酶切驗證成功(見圖1B-C)，構建出pET-28a-chIL-2、pGEX-6p-1-chIL-2 重組質粒，轉入工程菌后成功表達出目的蛋白。分別利用包涵體復興及親和層析的方法對目的蛋白進行純化，均獲得較好的純化效果(見圖1D-E)。

2.2 chIL-2 單克隆抗體的制備 經3 次免疫后，小鼠血清中chIL-2 抗體效價達到1∶128 000。細胞融合后利用間接ELISA方法對融合后細胞上清中chIL-2抗體進行檢測，共篩到6株陽性雜交瘤，經過3 次亞克和擴繁最終獲得3 株可穩定分泌chIL-2抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1C2，2F2，4B5。雜交瘤細胞注射小鼠腹腔進行腹水制備，經測定，3株單克隆抗體腹水的效價分別為：1C2：5.12×107，2F2:6.4×106,4B5:1.28×107。并將腹水純化獲得純化單抗。

圖1 重組表達載體的構建及融合蛋白的純化

A：chIL-2基因的克隆； B、C：重組表達載體pET-28a-chIL-2、pGEX-6p-1-chIL-2的雙酶切驗證；D、E：目的蛋白His-chIL-2、GST-chIL-2的純化

2.3 單克隆抗體性質的鑒定

2.3.1 單抗亞類的確定 根據抗體檢測試劑盒單抗亞類檢測方法，確定出3 株單抗的亞型均為IgG1。

2.3.2 單抗的純化及親和力測定 利用飽和硫酸銨法對所得腹水進行純化，對純化后的單抗進行親和力測定，3 株雜交瘤分泌的單抗親和力解離常數(Kd)分別為4.81×10-10(1C2)、1.36×10-10(2F2)以及4.15×10-9(4B5)，均為高親和力抗體(見圖2A～C)。

2.3.3 單抗識別抗原表位分析及特異性鑒定 經Western Blot 驗證3 株單抗分別識別的區域，單抗1C2 識別chIL-2 的1～40 位氨基酸，2F2 識別chIL-2 的81～121 位氨基酸，4B5 識別chIL-2 的41～80 位氨基酸(見圖3A-C)。即共獲得3 株分別識別不同位點的單抗。并且3株單抗均不能識別HIS 標簽的其他細胞因子，表現出良好的特異性(見圖3D)。

3 討論

IL-2 是免疫應答所必需的細胞因子，在T 細胞生長和分化、B細胞發育及NK細胞激活方面發揮重要的作用[12-13]。目前，許多的病原感染畜禽后會通過損害機體的免疫器官或免疫細胞造成免疫抑制或損傷。雖然對于各病原造成免疫抑制的機理尚不完全清楚，但有研究表明，多種病原所引起的免疫抑制與IL-2或IL-2R的表達紊亂有關[14]。李慶章等[15]報道，雞馬立克病病毒和雞傳染性貧血病毒感染后，雞胸腺、脾臟T細胞對有絲分裂原反應下降，IL-2 分泌受到抑制。這些研究表明，病毒可能通過直接或間接干擾IL-2 合成導致免疫抑制。

目前，國內對于IL-2 的研究主要集中于哺乳動物尤其是人IL-2，而對雞IL-2 的研究還十分有限，但因為IL-2 具有種屬特異性，雞IL-2 與哺乳動物IL-2 同源性相差較大，無交叉反應性，故目前很多可用于哺乳動物的實驗技術及從市面上商品化的檢測試劑盒不能用于雞IL-2 的研究，極大的限制了對于雞IL-2的深入研究。

在本研究中，我們利用誘導表達的His-chIL-2 蛋白免疫小鼠，按照常規方法取脾與骨髓瘤細胞進行融合，同時用GST-chIL-2 作為篩選蛋白，利用間接ELISA 方法篩選陽性雜交瘤。經過3 次亞克隆后共獲得3株能穩定分泌chIL-2抗體的雜交瘤。經過一系列特性檢測確定此3 株單抗均有較好的特異性和較高的親和力，而且這些單抗識別不同的抗原表位區域。在確定單抗識別的抗原表位區域時，由于chIL-2 的N 端有一段大小為11個氨基酸的信號肽，為了能更好的篩選到識別chIL-2 的單抗，故首先設計了去除信號肽的成熟chIL-2 即MIL-2，大小約121 個氨基酸，在此基礎上又分別從其C 端和

圖2 chIL-2單克隆抗體親和力的測定

圖3 單抗識別抗原表位分析及特異性鑒定

A：各截短蛋白示意圖 ； B：Western Blot分析3株單抗對不同截短蛋白的識別情況 ；C：3株單抗抗原表位識別區域示意圖 ； D：3株單抗特異性鑒定N端以40個氨基酸為一段對成熟chIL-2進行截短。在WesternBlot中，MIL-2有時會曝出兩條帶，用抗His單抗作為一抗曝出的條帶尤為明顯。其原因是由于蛋白發生部分降解，故會曝出一條小于MIL-2正常大小的條帶，而與單抗的特異性無關。綜上所述，本研究所獲得的3株chIL-2單抗具有特異性好、效價高的優點，可用于建立檢測雞IL-2方法或試劑盒，為深入研究雞IL-2的生物學作用提供物質基礎。

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Development and identification of monoclonal antibodies against chIL-2

FU Meng-jiao ， WANG Yong-qiang ， CAO Hong ，LI Xiao-qi ， ZHENG Shi-jun

(State Key Laboratory of Agrobiotechnology，College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

To develop monoclonal antibodies against chicken IL-2，We constructed the prokaryotic expression vector of chIL-2 and expressed His-chIL-2 protein first，and then immunized BALB/c mice with purified HIS-IL-2 protein.After three-time immunizations we obtained hybridomas via fusion of mouse spleen with sp2/0 myeloma.Indirect ELISA method was used to screen fused cells for positive hybridomas.Finally we got three hybridomas that could stably secret chIL-2 McAbs，and these hybridomas were named 1C2，2F2，and 4B5 respectively.The characteristics of the three McAbs were determined，and the results showed that the isotypes of these McAbs were IgG1.We examined the dissociation constants(Kd)of these McAbs，and found that their Kds were 4.81×10-10，1.36×10-10，4.15×10-9，respectively.The recognizing domains of chIL-2 by 1C2，2F2 and 4B5 were located in three different areas as demonstrated by Western Blot analysis.And three monoclonal antibodies could specifically recognize chIL-2.These McAbs would help to elucidate the functions of chIL-2.

chIL-2 ; prokaryotic expression ; monoclonal antibodies

s: ZHENG Shi-jun ； LI Xiao-qi

2015-08-11

現代農業產業技術體系建設專項資金(NYCYTX-41)

付夢姣(1989-)，女，博士生，從事預防獸醫學研究，E-mail：rainshenmin@163.com

鄭世軍，sizheng@cau.edu.cn；李曉齊，leexiaoqi@cau.edu.cn

S852.4

A

0529-6005(2016)11-0006-04