益生菌對新城疫疫苗免疫雛雞免疫器官T細胞增殖能力和IL-2 mRNA表達影響

白 玉 ， 李 琰 ， 高雪麗 ， 劉超男 ， 呂曉萍 ， 鄭世民

(1.東北農業大學動物醫學學院， 黑龍江哈爾濱150030 ； 2. 四川省畜牧科學研究院， 四川成都610066)

益生菌對新城疫疫苗免疫雛雞免疫器官T細胞增殖能力和IL-2 mRNA表達影響

白 玉1， 李 琰2， 高雪麗1， 劉超男1， 呂曉萍1， 鄭世民1

(1.東北農業大學動物醫學學院， 黑龍江哈爾濱150030 ； 2. 四川省畜牧科學研究院， 四川成都610066)

為探索益生菌對新城疫(ND)疫苗免疫雛雞的免疫效果影響。 將100只1日齡AA肉雞隨機分為益生菌組、 ND疫苗單獨免疫組、 益生菌聯合ND疫苗應用組和空白對照組。 采用MTT法和實時熒光定量PCR法檢測各試驗雛雞于ND疫苗兩次應用后0、 7、 14、 28、 42 d胸腺、 脾臟中細胞免疫功能及IL-2 mRNA的表達。 結果發現， 益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后， 其胸腺和脾臟中T細胞增殖能力和IL-2 mRNA表達， 分別于ND疫苗免疫后7～28 d明顯(P<0.05或P<0.01)高于ND疫苗或益生菌單獨應用雛雞。 表明益生菌可通過提高雛雞免疫器官中T細胞增殖功能和IL-2 mRNA表達， 發揮增強ND疫苗免疫效應作用。

益生菌 ； 新城疫疫苗 ； T細胞增殖能力 ； 白細胞介素-2 mRNA表達

益生菌是活的，有助于機體腸道微生物區系平衡和健康的無致病性細菌，通過在機體腸道內與致病菌頡頏、免疫調節、組織修復等作用促進動物生長、發育，保障動物健康[1]。目前，抗生素的不正當使用，尤其是濫用造成超級細菌的產生和嚴重的藥物殘留等問題，不但已引起了廣大學者的高度關注，在某方面也得到了許多國家政府的高度重視，故探索或尋找行之有效的抗生素替代品一直是科技工作者努力的方向和研究熱點之一[2]。益生菌所具有的安全可靠，無毒副作用，無耐藥殘留等生物特性而得到學者的高度重視[3]。綜合目前已有研究資料，對益生菌與疫苗聯合應用方面的系統研究較少，故本試驗旨通過T細胞對ConA增殖和IL-2 mRNA表達的檢測，在細胞水平與mRNA水平闡述益生菌和ND疫苗聯合免疫雛雞后，其對雛雞免疫器官細胞免疫功能的影響，為益生菌在動物醫學界應用提供試驗理論依據。

1 試驗材料

1.1 試驗動物 1日齡AA肉雞100只，雌雄各半，購自哈爾濱市某孵化場，經NDV、MDV、IBDV等檢測均為陰性。

1.2 益生菌 產酶益生菌，購自山東華爾康生物技術有限公司，生產批號為飼添字(2007)11178號，按產品說明書使用。

1.3 ND疫苗 LaSota弱毒苗(Ⅳ系)，購自哈藥集團生物制品一廠，批號為200861， 按說明書使用。

1.4 試驗動物分組及處理 100只雛雞隨機分為4組，即益生菌組(P組)、ND疫苗單獨免疫組(V組)、益生菌聯合ND疫苗組(P+V組)和空白對照組(C組)。其中，P組和P+V組雛雞分別在1日齡和18日齡連續灌服益生菌稀釋液3 d，1次/天(0.1mL/次，5×109CFU/mL)；V組和P+V組雛雞分別在10日齡和21日齡經滴鼻、點眼接種LaSota弱毒苗，且21日齡免疫劑量為10日齡的2倍；C組雛雞灌服生理鹽水。

1.5 被檢材料采取及處理 4組雛雞分別于第二次接種LaSota疫苗后0、7、14、28、42 d，每組隨機抽取5只雛雞，心臟采血處死，無菌快速采取胸腺、脾臟一部分制成單細胞懸液進行組織細胞培養，用于T細胞增殖能力檢測；另一部分于液氮中速凍，然后轉入-80℃冰箱中凍存，用于IL-2 mRNA 表達檢測。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 胸腺、脾臟T細胞增殖能力的檢測 胸腺、脾臟T細胞增殖能力檢測，采用細胞培養及MTT檢測法[4]，于全自動酶標儀上，測定590nm下的OD值。

1.6.2 雞免疫器官IL-2 mRNA表達量的檢測 雞IL-2 mRNA表達量測定，應用實時熒光定量PCR法[5]。

2.結果

2.1 益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后胸腺、脾臟T細胞增殖能力變化 益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后，其胸腺和脾臟中T細胞增殖能力與ND疫苗單獨免疫雛雞和益生菌單獨應用雛雞相比均不同程度升高，其中胸腺T細胞增殖能力于疫苗免疫后 7～28 d顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于ND疫苗單獨免疫雛雞及益生菌單獨應用雛雞；脾臟中T細胞增殖能力分別于疫苗免疫后7～14 d和7～28 d顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于ND疫苗單獨免疫雛雞和益生菌單獨應用雛雞(圖1，2)。

圖1 益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后胸腺T 細胞增殖能力變化

圖2 益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后脾臟T細胞增殖能力變化

2.2 益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后胸腺、脾臟IL-2 mRNA表達量變化 益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后，其胸腺、脾臟IL-2 mRNA表達量于疫苗免疫后7～14 d顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于ND疫苗單獨免疫雛雞，于7～28 d也明顯(P<0.05或P<0.01)高于益生菌單獨應用雛雞(圖3，4)。

3.討論

T細胞在雛雞體內主要集中在胸腺和脾臟中，T細胞不僅可以直接殺傷靶細胞，還可調節B細胞產生抗體，對特異性抗原和有絲分裂原產生免疫應答，同時T細胞還能產生多種細胞因子，如IL-2INF-γ等發揮免疫調節作用。本研究發現，益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后，其胸腺和脾臟中T細胞對ConA的增殖能力較ND疫苗單獨免疫雛雞和益生菌單獨應用雛雞均有不同程度的增強，產生上述結果的可能原因是：雛雞飼喂益生菌后，益生菌在機體腸道中定植，合成大量維生素等營養物質，促進機體免疫器官發育及功能的發揮，使胸腺和脾臟中T細胞對有絲分裂原的反應能力增強。Filho等[6]研究發現，雛雞飼喂嗜酸性乳酸桿菌后，其腸道黏膜中CD8+T細胞和Th2細胞數量明顯高于對照雛雞；另外，益生菌其自身可作為抗原物質刺激機體免疫系統，激發免疫應答，T細胞又是機體細胞免疫的主要免疫活性細胞，其免疫應答功能的增強，表明動物機體的細胞免疫功能提高；益生菌菌體的肽聚糖和脂多糖等成分，以免疫佐劑形式作用于機體免疫器官，促進機體的免疫反應，所以當雛雞飼喂益生菌后，機體處于高水平的免疫反應狀態，LaSota弱毒苗(Ⅳ系)免疫雛雞后，機體發生高水平的免疫反應，使T細胞增殖較ND疫苗單獨免疫雛雞更加顯著。

圖3 益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后胸腺IL-2 mRNA表達變化

圖4 益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后脾臟IL-2 mRNA表達變化

益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后，其免疫器官中IL-2 mRNA表達均高于ND疫苗單獨免疫雛雞，說明益生菌不僅可以提高雛雞免疫器官中T細胞增殖能力，還可促進雛雞免疫器官IL-2 mRNA表達，其主要原因是：IL-2主要由Th1、Tc和NK細胞產生，雛雞飼喂益生菌后，其菌體成分，如肽聚糖具有免疫刺激活性，可促進雛雞體內巨噬細胞分泌IL-1，而后者可活化Th細胞，使其分泌大量IL-2，故益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞的免疫器官中IL-2 mRNA表達高于ND疫苗單獨免疫雛雞，而IL-2又可作用于T細胞自身的調節物，促進T細胞增殖、分化及細胞因子的產生。胸腺含有大量T細胞，所以飼喂益生菌雛雞，其胸腺中T細胞增殖效果更加明顯，且IL-2 mRNA表達量也顯著增加。于志強等[7]研究發現，益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后，其黏膜免疫器官中IL-2 mRNA表達均高于單獨應用ND疫苗免疫雛雞及對照雛雞，本研究結果與上述已有研究報道基本一致。

綜上所述，益生菌聯合ND疫苗免疫雛雞后，其胸腺、脾臟中T細胞增殖能力和IL-2 mRNA表達與ND疫苗單獨免疫雛雞和飼喂益生菌雛雞相比均明顯增加，說明益生菌能夠提升機體免疫能力，益生菌聯合疫苗免疫雛雞的免疫效果顯著優于疫苗和益生菌單獨應用雛雞。

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[2] Pan S J，Kuo C H，Lam K P，etal．Probiotics and allergy in children-an update review[J]．Pediatr Allergy Immunol，2010，21(42)：659-666．

[3] Zamith-Miranda D，Palma M L，Matos G S，etal．Lipid droplet levels vary heterogeneously in response to simulated gastrointestinal stresses in different probioticSaccharomycescerevisiaestrains[J]．Journal of Functional Foods，2016，21：193-200．

[4] 王彥，王長征．MTT法檢測卵蛋白刺激哮喘小鼠脾淋巴細胞增殖最佳試驗條件的研究[J]．毒理學雜志，2014，28(3)：170-172．

[5] 呂曉萍，申海龍，鄭世民．雞白細胞介素-2 mRNA表達 SYBR GREEN1 Real-time PCR檢測方法的建立與應用[J]．中國家禽，2015，37(2)：21-25．

[6] Filho R A，Díaz S J，Fernando F S，etal．Immunomodulatory activity and control of Salmonella Enteritidis colonization in the intestinal tract of chickens by Lactobacillus based probiotic[J]．Veterinary Immunology and Immunopathology，2015，167：64-69．

[7] 于志強，呂曉萍，高雪麗，等．益生菌及其聯合新城疫疫苗免疫雛雞局部黏膜組織IL-2 mRNA表達的變化[J]．中國獸醫雜志，2014，50(2)：20-23．

Influence of Probiotcs on T cell Proliferation Function and IL-2 mRNA Expression in Immune Organs of Chicks Vaccinated with Newcastle Disease Vaccine

BAI Yu1， LI Yan2， GAO Xue-li1， LIU Chao-nan1， LV Xiao-ping1， ZHENG Shi-min1

(1.College of Veterinary Medicine， Northeast Agricultural University， Harbin 150030, China ；2.Sichuan Animal Science Academy， Chengdu 610066， China)

In order to explore the effects of probiotics on the immune response in chicks vaccinated with Newcastle disease(ND)vaccine, 100 1-day-old AA broilers were randomly divided into probiotics alone group, ND vaccine alone immune group, probiotics and ND vaccine combination group, and blank control group. Test samples of chicks in each group after ND vaccination were collected at 0,7,14,28,and 42 days post vaccination. The cellular immune function and IL-2 mRNA expression in thymus and spleen of probiotics-fed chicks vaccinated with ND vaccine were detected by MTT and RT-PCR. The results showed that the proliferation function of T cell in thymus and spleen of probiotics-fed chicks vaccinated with ND vaccine were significanty higher(P<0.05 orP<0.01)than vaccination alone or probiotics-fed chicks at 7～28 days after vaccination. These data show that probiotics can enhance the immune efficacy of ND vaccine by enhancing the proliferation of T cells and IL-2 mRNA expression in thymus and spleen of chicks.

probiotic; Newcastle disease vaccine; proliferation function of T cell; IL-2 mRNA expression

ZHENG Shi-min

2016-03-25

國家自然科學基金(30972162)

白玉(1991- )，男，碩士生，主要從事動物免疫病研究，E-mail：baiyu618@sohu.com

鄭世民，E-mail：zhenghsiminbl@sohu.com

S852.33

A

0529-6005(2016)11-0001-03