知母醇提物對(duì)INS-1胰島β細(xì)胞功能的影響

張國(guó)改，曾平燕，肖雪蓉，馮毅凡，吳霞

(1.廣東藥科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006； 2.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510530)

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知母醇提物對(duì)INS-1胰島β細(xì)胞功能的影響

張國(guó)改1，曾平燕2，肖雪蓉1，馮毅凡1，吳霞1

(1.廣東藥科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006； 2.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510530)

目的 研究知母醇提物對(duì)正常和抵抗INS-1胰島β細(xì)胞的增殖及分泌功能的影響，探討知母醇提物對(duì)正常細(xì)胞的毒性影響以及對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞的改善作用。方法 采用MTT法測(cè)定知母醇提物對(duì)正常INS-1胰島β細(xì)胞的增殖作用；知母醇提物干預(yù)正常細(xì)胞及胰島素抵抗INS-1胰島β細(xì)胞，分為溶媒組(ME)、胰島素分泌模型組(MC)、胰島素抵抗組(IR)、陽(yáng)性藥格列本脲組(Gli)和羅格列酮組(ROZ)及知母醇提物組，測(cè)定各組基礎(chǔ)胰島素分泌(BIS)和葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)值。結(jié)果 知母醇提物質(zhì)量濃度在0.3～30 μg/mL時(shí)對(duì)正常細(xì)胞有明顯的增殖作用，與MC組的GSIS比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與IR組的BIS和GSIS比較，知母醇提物濃度在3～30 μg/mL能顯著促進(jìn)細(xì)胞的BIS能力，同時(shí)其質(zhì)量濃度在0.3～30 μg/mL能顯著性促進(jìn)GSIS功能。結(jié)論 知母醇提物在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)正常INS-1胰島β細(xì)胞的毒性較低，同時(shí)能通過(guò)促進(jìn)正常細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其胰島素分泌能力，改善細(xì)胞自身的胰島素抵抗。

知母醇提物； INS-1胰島β細(xì)胞； 增殖； 毒性

中藥知母(AnemarrhenaeRhizoma)為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖，現(xiàn)代藥理研究表明其具有改善記憶力[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]、抗腫瘤[4]、降血糖[5]、降脂[6]等多種藥理活性。其主要的活性成分包括知母皂苷、雙苯吡酮和知母多糖等[7]。知母醇提物主要包括知母皂苷和雙苯吡酮。目前，國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道了知母可以促進(jìn)胰島素分泌，改善胰島素抵抗(IR)，降低血糖以及維持血糖穩(wěn)定，用于治療2型糖尿病，并對(duì)糖尿病并發(fā)癥包括白內(nèi)障、血脂代謝紊亂等有防治作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究知母醇提物對(duì)正常INS-1胰島β細(xì)胞的增殖作用，以及胰島素的分泌功能，摸索給藥劑量，探討其對(duì)正常INS-1胰島β細(xì)胞的毒性影響及是否有增強(qiáng)細(xì)胞功能等作用；持續(xù)高糖刺激INS-1胰島胰島β細(xì)胞，使其出現(xiàn)IR現(xiàn)象，考察知母醇提物對(duì)IR的INS-1細(xì)胞的改善作用。

1 材料

1.1 儀器

倒置顯微鏡(江南顯微鏡有限公司)；BP210分析天平(Sartorius公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-RAD)；-80 ℃超低溫冰箱(中科美菱公司)；KDC-220HR 高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材與試劑

知母藥材購(gòu)自廣州致信藥業(yè)有限公司，由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、丙酮酸鈉、β-巰基乙醇、0.05%胰酶-EDTA(Gibco)；HEPES(雷根生物)；DMSO(Sigma)；PBS緩沖溶液(Gibco)；MTT粉(廣州瑞舒生物科技有限公司)；格列苯脲、羅格列酮(左克齊云試劑)。

1.3 細(xì)胞

INS-1胰島β細(xì)胞株即大鼠胰島素瘤細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 溶液的配制

完全培養(yǎng)液：取5 mL 100×雙抗，50 mL FBS，500 μL HEPES溶液，500 μL 丙酮酸鈉溶液，50 μLβ-巰基乙醇，加到450 mL 基礎(chǔ)RPMI1640培養(yǎng)液中即可，4 ℃保存，2周有效。細(xì)胞凍存液：按照FBS∶DMSO=9∶1(體積比)配置，置于4 ℃預(yù)冷，現(xiàn)配現(xiàn)用。刺激INS-1胰島細(xì)胞分泌用葡萄糖母液：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.68 g葡萄糖粉末，并溶于4 mL PBS，用0.22 μL微孔濾膜過(guò)濾并分裝，于-20 ℃保存即可。知母醇提物制備參考本實(shí)驗(yàn)室課題組前期的研究[9]，稱(chēng)取知母藥材300 g，粉碎，加入8倍量80%乙醇，加熱回流提取2次每次1 h，合并提取液，濃縮干燥即得。知母醇提物溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取1 mg 知母醇提物，加入適量的DMSO溶解提取物，配成0.1 mg/μL的母液，于-20 ℃保存。

2.2 MTT法測(cè)定INS-1胰島β細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的INS-1胰島細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至3×104個(gè)/ mL，接種于96孔板，設(shè)24、48、72、96、120 h這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各設(shè)6個(gè)復(fù)孔及相應(yīng)空白對(duì)照。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取對(duì)應(yīng)孔板，小心棄上清后加入120 μL含MTT溶液的基礎(chǔ)培養(yǎng)液(1∶5),37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h,570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.3 MTT法測(cè)定知母醇提物對(duì)正常INS-1胰島β細(xì)胞增殖的作用

實(shí)驗(yàn)分為空白組(KB)、溶媒組(ME，內(nèi)含0.01%DMSO)、知母醇提物組(ZM)，其質(zhì)量濃度分別為0.3、3、30、60、80、200 μg/mL。取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，接種于96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，預(yù)培養(yǎng)24 h，分組給藥作用48 h后，小心吸棄上清培養(yǎng)液，MTT法，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值。以存活率表示INS-1胰島細(xì)胞的增殖程度：存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零組A值)/(空白對(duì)照組A值-調(diào)零組A值)×100 %。

2.4 知母醇提物對(duì)正常INS-1胰島β細(xì)胞胰島素分泌的影響

實(shí)驗(yàn)分為溶媒組(ME，內(nèi)含0.01%DMSO)、胰島素分泌模型組(MC，內(nèi)含0.01%DMSO+5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖)、陽(yáng)性藥(格列苯脲)組(Gli，內(nèi)含0.15 μmol/L格列苯脲 + 5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖)、知母醇提物組(分別為30、3、0.3 μg/mL的知母醇提物+ 5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，接種于48孔板，預(yù)培養(yǎng)24 h后，按分組給藥干預(yù)，藥物作用48 h后，小心吸棄上清培養(yǎng)液，PBS洗后加入300 μL/孔無(wú)糖培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中平衡30 min，基礎(chǔ)葡萄糖糖刺激組(BIS)，高糖刺激組(GSIS)分別給予5.6 mmol/L、16.7 mmol/L葡萄糖-無(wú)糖培養(yǎng)溶液，300 μL/孔；空白組給予相同體積無(wú)糖培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1 h后，取上清液，-20 ℃保存待測(cè)胰島素量。

2.5 知母醇提物對(duì)IR的INS-1胰島β細(xì)胞分泌的影響

實(shí)驗(yàn)分為胰島素分泌模型組(MC)：0.01%DMSO+5.6 mmol/L或16.7 mmol/葡萄糖；胰島素抵抗模型組(IR)：40 mmol/L葡萄糖+0.01%DMSO+5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖；陽(yáng)性藥(羅格列酮)組(ROZ)：40 mmol/L葡萄糖+1.0 μmol/L羅格列酮+ 5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖；知母醇提物組：30、3、0.3 μg/mL知母醇提物+40 mmol/L葡萄糖+ 5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，接種于48孔板。預(yù)培養(yǎng)24 h后，小心吸棄上清培養(yǎng)液，按分組給藥干預(yù)。除胰島素分泌模型組外，其余各組加入含40 mmol/L葡萄糖的含藥培養(yǎng)基，干預(yù)48 h后，其余步驟同上。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 正常INS-1胰島β細(xì)胞的形態(tài)特征

正常的INS-1細(xì)胞在顯微鏡下形態(tài)完整，折光性好，細(xì)胞膜邊緣有明亮的光環(huán)，胞質(zhì)內(nèi)含有較多黑色點(diǎn)狀胰島素分泌顆粒且呈聚集生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

a b

圖1 INS-1細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)特征(a. 100×； b. 400×)

Figure 1 Morphology of INS-1 cells under the microscope (a. 100×; b. 400×)

3.2 INS-1胰島β細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

由圖2可見(jiàn)，INS-1細(xì)胞約24 h后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；48～72 h，細(xì)胞呈快速增長(zhǎng)，處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；72～120 h，細(xì)胞基本停止增長(zhǎng)，進(jìn)入平穩(wěn)期。

0.50.40.30.20.1A57024487296120144t/h

圖2 INS-1細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

Figure 2 Growth curve of INS-1 cells

3.3 知母醇提物對(duì)正常INS-1胰島β細(xì)胞的增殖作用

從表1可見(jiàn)，知母醇提物在濃度范圍0.3～30 μg/mL時(shí)，對(duì)INS-1細(xì)胞有較為明顯的增殖作用(P<0.05或者P<0.01)。但是隨著給藥濃度的不斷增加，知母醇提物對(duì)INS-1的增殖作用呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì)。

表1 知母醇提物對(duì)正常INS-1細(xì)胞的增殖作用

組別劑量/(μg·mL-1)存活率/%空白組-100溶媒組0.01%DMSO100.17±3.81知母醇提物組0.3106.86±5.40*3112.29±6.35**30108.80±5.24**60108.23±5.26**80105.51±3.53*20092.71±6.90*

與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01。

3.4 知母醇提物對(duì)正常INS-1胰島β細(xì)胞胰島素釋放的影響

知母醇提物對(duì)正常 INS-1胰島β細(xì)胞的BIS、GSIS作用結(jié)果：(1)與模型組BIS比較，知母醇提物各個(gè)濃度均對(duì)INS-1細(xì)胞的BIS功能無(wú)明顯影響(P>0.05);(2)與模型組GSIS比較，知母醇提物給藥濃度為0.3、30 μg/mL時(shí)，顯著增強(qiáng) INS-1細(xì)胞的GSIS功能(P<0.05)，而在給藥濃度為3 μg/mL時(shí)表現(xiàn)最為顯著(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 知母醇提物對(duì)正常INS-1細(xì)胞胰島素釋放的影響

組別劑量/(μg·mL-1)ρ(胰島素)/(mU·L-1)BISGSIS溶媒組-7.05±0.837.05±0.83模型組-9.16±1.19**12.52±0.34**格列本脲組0.15μmol/L10.91±0.55##14.02±0.27△△知母醇提物組308.60±0.6013.55±0.64△310.19±0.9813.86±0.44△△0.39.22±1.1411.58±0.79△

與溶媒組比較：**P<0.01； 與模型組BIS值比較：##P<0.01； 與模型組GSIS值比較：△P<0.05，△△P<0.01。

3.5 知母醇提物對(duì)IR的INS-1胰島β細(xì)胞胰島素釋放的影響

知母醇提物對(duì)高糖誘導(dǎo)的IR的INS-1細(xì)胞的BIS、GSIS作用結(jié)果：(1)與IR模型組BIS比較，知母醇提物在給藥濃度為30、3 μg/mL時(shí)均能顯著促進(jìn)IR的INS-1細(xì)胞的基礎(chǔ)分泌能力(P<0.05或P<0.01)；(2)與IR模型組GSIS比較，知母醇提物給藥濃度為30、0.3 μg/mL均能顯著促進(jìn)IR的INS-1細(xì)胞的GSIS功能(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 知母醇提物對(duì)IR的INS-1細(xì)胞胰島素釋放的影響

組別c(葡萄糖)/(mmol·L-1)干預(yù)劑量/(μg·mL-1)ρ(胰島素)/(mU·L-1)BISGSIS模型組--9.16±1.1912.52±0.34胰島素抵抗組40-9.48±0.6610.86±0.64**羅格列酮組401μmol/L11.45±1.21##12.27±0.46△△知母醇提物組403011.11±1.14#14.89±0.85△△40312.94±0.74##11.74±0.65400.310.36±0.7612.70±1.05△△

與模型組比較：**P<0.01； 與IR 的BIS值比較：#P<0.05，##P<0.01； 與IR 的GSIS值比較：△△P<0.01。

4 討論

4.1 知母醇提物對(duì)正常INS-1細(xì)胞增殖作用的評(píng)價(jià)

機(jī)體糖代謝異常及胰島素分泌紊亂與胰島β細(xì)胞數(shù)量的減少密切相關(guān)[10]。若藥物能夠促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖，即可直接增加細(xì)胞數(shù)量，間接增加胰島素分泌量，從而改善糖尿病的糖代謝異常及胰島素分泌紊亂。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在給藥濃度0.3～30 μg/mL時(shí)，知母醇提物能顯著促進(jìn)INS-1胰島細(xì)胞的增殖，表明中藥知母對(duì)胰島β細(xì)胞增殖具有明顯的促進(jìn)作用，有利于增加胰島素分泌細(xì)胞總量，提高胰島素的水平，從而對(duì)抗糖尿病時(shí)高糖環(huán)境對(duì)β細(xì)胞損傷。

IR作為2型糖尿病(T2DM)另一重要的發(fā)病機(jī)制，一直受到廣泛的關(guān)注。近來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)IR不只發(fā)生在外周靶細(xì)胞上，胰島β細(xì)胞本身也有胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也會(huì)發(fā)生IR[11]。因此，若能及早改善胰島β細(xì)胞IR，將有利于保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，延緩T2DM的發(fā)生與發(fā)展。而T2DM的主要表現(xiàn)為BIS和GSIS能力下降，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，高糖刺激下建立的INS-1細(xì)胞胰島素抵抗模型主要損害了細(xì)胞的GSIS能力，而知母醇提物在一定程度上能增強(qiáng)細(xì)胞的BIS和GSIS，減輕自身的IR。

4.2 知母醇提物對(duì)INS-1細(xì)胞的胰島素分泌作用評(píng)價(jià)

T2DM發(fā)病機(jī)理主要?dú)w結(jié)為兩個(gè)方面：其一，胰島細(xì)胞損傷、功能異常，導(dǎo)致胰島素分泌缺陷。即機(jī)體長(zhǎng)期高血糖使機(jī)體胰島素分泌障礙，加重了胰島細(xì)胞的負(fù)荷，最終導(dǎo)致胰島細(xì)胞的損傷，胰島素分泌功能異常；研究人員認(rèn)為氧化應(yīng)激因子如高血糖、高血脂、肥胖等為T(mén)2DM高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)病因子。因此，改善機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，減少甚至去除這些氧化應(yīng)激因子，對(duì)T2DM的治療具有非常重要意義；其二，IR指外周靶組織對(duì)胰島素的敏感性降低以及胰島β細(xì)胞自身過(guò)代償分泌胰島素導(dǎo)致胰島素分泌能力減弱。因此，如果能夠增強(qiáng)正常胰島β細(xì)胞的胰島素分泌，使其在高糖刺激下仍能穩(wěn)定分泌胰島素，將為T(mén)2DM的治療帶來(lái)新的契機(jī)。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，知母皂苷可以恢復(fù)機(jī)體胰島β細(xì)胞的功能，增強(qiáng)外周組織對(duì)胰島素的敏感性[12]，并可以通過(guò)抑制某些受體從而介導(dǎo)代謝通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，減少T2DM并發(fā)癥[13]；雙苯吡酮類(lèi)也被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)糖尿病大鼠能量代謝，降低IR，調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)水平等作用[14-15]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示[9]，本實(shí)驗(yàn)所用知母醇提物含有知母皂苷和雙苯吡酮兩大類(lèi)藥效成分，與已有報(bào)道的相關(guān)研究文獻(xiàn)一致[7,9]。在給藥干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，知母醇提物可明顯促進(jìn)正常INS-1細(xì)胞的增殖，并且對(duì)正常INS-1細(xì)胞和IR的INS-1細(xì)胞增強(qiáng)其釋放胰島素的作用，從而增強(qiáng)正常細(xì)胞的功能，當(dāng)細(xì)胞遭遇高糖刺激時(shí)減少其產(chǎn)生IR的效應(yīng)，該實(shí)驗(yàn)對(duì)研究增強(qiáng)胰島素細(xì)胞功能的藥物提供了一定的指導(dǎo)意義。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Effect of alcohol extract of Anemarrhenae Rhizoma on INS-1 islet β cells

ZHANG Guogai1,ZENG Pingyan2,XIAO Xuerong1,FENG Yifan1,WU Xia1

(1.CentralLaboratory,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.GuangzhouXiangxuePharmaceuticalCo.,LTD,Guangzhou510530,China)

Objective To study the effect of alcohol extract ofAnemarrhenaeRhizomaon the proliferation and secretary function of normal and resistant INS-1 islet β cells,and investigate the toxic effect of alcohol extract on normal INS-1 islet β cells and improvement effect of alcohol extract on the resistant INS-1 islet β cells. Methods The proliferation of normal INS-1 cells was measured by MTT assay. The normal cells and the insulin-resistant cells were treatment with alcohol extracts. The experiment was divided into different groups,including the vehicle group (ME),insulin secretion model group (MC),insulin resistance group (IR),positive drug glibenclamide urea (Gli) group and rosiglitazone (ROZ) group,and several concentrations of alcohol extract groups. The basal insulin secretion (BIS) and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) values were measured. Results Treatment with alcohol extract ofAnemarrhenaeRhizomaat 0.3～30 μg/mL contributed to the proliferation of normal cells. Compared with MC and alcohol extracts,the difference of GSIS was statistically significant (P<0.05 orP<0.01). Compared with IR,alcohol extracts increased the levels of BIS at 3-30 μg/mL and GSIS at 0.3-30 μg/mL. Conclusion The toxicity of alcohol extracts on normal islet beta cells is low in a certain concentration range. Alcohol extracts could promote the proliferation of normal cells and insulin secretion ability to improve insulin resistance of cells.

alcohol extract ofAnemarrhenaeRhizoma; INS-1 islet β cells; proliferation; toxic effect

2016-09-18

廣東省重大科技專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2013A022100040)；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目(A2015448)

張國(guó)改(1989—)，女，2014級(jí)碩士研究生，Email:zggcbl521@126.com；通信作者：馮毅凡(1963—)男，教授，主要從事現(xiàn)代儀器分析技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用與中藥分析與質(zhì)量控制，Email：yffeng@139.com；吳霞(1980—)，女，博士，副研究員，主要從事天然藥物活性成分和藥物分析研究，Email：wxiaxia@163.com。

時(shí)間：2016-11-29 11:27

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161129.1127.011.html

R285.5

A

1006-8783(2016)06-0762-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016091801