UPLC法測定蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B的含量

周賢珍，陳偉英，劉博，果德安，3，周毅生

(1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院/廣東省中醫藥科學院，廣東 廣州 510006； 3.中國科學院上海藥物研究所/上海中藥現代化研究中心，上海 201203)

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UPLC法測定蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B的含量

周賢珍1，陳偉英2，劉博2，果德安2，3，周毅生1

(1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院/廣東省中醫藥科學院，廣東 廣州 510006； 3.中國科學院上海藥物研究所/上海中藥現代化研究中心，上海 201203)

目的 建立同時測定蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B的質量分數的超高效液相(UPLC)法。方法 采用UPLC-PDA方法，色譜柱為ACQUICTY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流動相為甲醇-質量分數0.2%的冰醋酸水溶液，梯度洗脫，洗脫時間7.5 min，柱溫40 ℃，流量為0.3 mL/min，檢測波長為280 nm。進樣量為10 μL。結果 巴西蘇木素和原蘇木素B均達到基線分離，質量濃度在0.195～200 μg/mL范圍內與峰面積有良好的線性關系，R2均為0.999 8；平均回收率分別為103.89%、99.83%，RSD為1.26%、1.87%。結論 相比HPLC法，UPLC法明顯提高了同時檢測蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B質量分數的分析速度，并且靈敏度更高，可為以后建立蘇木質量檢測方法新標準提供參考。

超高效液相色譜法； 蘇木； 巴西蘇木素； 原蘇木素B； 含量測定

蘇木(SappanLignum)為豆科植物蘇木(CaesalpiniasappanL.)的干燥心材[1]，具有舒筋通絡、活血散結等功效[2]。巴西蘇木素和原蘇木素B是蘇木中2個重要的活性成分[3]。已有文獻報道，巴西蘇木素具有抗痤瘡、降血糖、血管舒張、保肝、抗腫瘤、免疫調節、抗氧化、抗菌、抗感染[4-6]等藥理活性，原蘇木素B也具有較好的抗菌和抗腫瘤活性[7-9]。

2010年版《中國藥典》[10]蘇木項下含量測定采用的是HPLC技術，運行時間長達50 min，耗時較長。而2015年版《中國藥典》[11]蘇木項下沒有含量測定相關說明，但在“高效液相色譜法”項下指出超高效液相色譜儀(UPLC)是適應小粒徑(約2 μm)填充劑的新型高效液相色譜儀，具有耐高壓、進樣量小、死體積低、靈敏度高的優點，有利于檢測效率和檢測質量的提高。國家藥典委員會及許多學者[12]都開始致力于UPLC技術的推廣。本文首次將UPLC技術應用于蘇木中有效成分的測定分析，建立一種簡單高效的方法同時測定蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B的質量分數，為建立蘇木的質量檢測方法新標準提供參考。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜(美國Waters公司)；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱 (美國Waters公司，2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；8510超聲波清洗器(美國Branson公司)；BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；P/N Hei-VAP precision ML/G3旋轉蒸發儀(德國Heidolph公司)；5418R冷凍式離心機(德國Eppendorf公司)。

蘇木(康美藥業股份有限公司，批號：141102861，由上海藥物研究所上海中藥現代化研究中心果德安教授鑒定為豆科植物蘇木CaesalpiniasappanL.的干燥心材)；巴西蘇木素對照品(成都普思生物科技有限公司，純度質量分數>99.2%，批號：PS000105，采用1H-NMR、13C-NMR和質譜法進行結構確證，并用高效液相色譜法測試對照品純度)；原蘇木素B對照品(成都普思生物科技有限公司，純度質量分數>98.8%，批號：PS001125，采用1H-NMR、13C-NMR和質譜法進行結構確證，并用高效液相色譜法測試對照品純度)；乙腈(色譜級，默克股份有限公司)；冰醋酸(分析純，天津富宇精細化工有限公司)；水為超純水(默克密理博有限公司，ELIX超純水系統)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性

色譜柱采用ACQUICTY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相為甲醇(A)-0.2%的冰醋酸水溶液(B)，進行梯度洗脫(0 min，5%A；0.5 min，20%A；3.4 min，28%A；7 min，29.5%A；7.5 min，5%A)；采用PDA檢測器，檢測波長為280 nm，流速為0.3 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為40 ℃，樣品室溫為4 ℃，空白試劑為超純水。對照品與樣品的色譜圖見圖1?？梢?，空白試劑無干擾，巴西蘇木素和原蘇木素B保留時間分別為4.43、5.12 min。

0.0080.0040.000AU0.0080.0040.0000.300.200.100.00AUAU01234567t/min1221ABC

A.空白對照； B.蘇木水提物凍干粉； C.巴西蘇木素對照品和原蘇木素B對照品混合液； 1.巴西蘇木素; 2.原蘇木素B。

圖1 蘇木對照品及水提物的UPLC色譜圖

Figure 1 UPLC chromatogram of reference and water extract of Sappan Lignum

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取蘇木粗粉100 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，用800 mL超純水浸泡12 h。浸泡結束后，用電熱套加熱煮沸，采用索氏提取法，常壓回流提取3次，每次1 h，使液體均勻回流，將每次得到的提取液合并，采用旋轉蒸法儀將提取液濃縮至100 mL，參照文獻[14-15]中蘇木水提物處理方法，待濃縮液冷卻至室溫，置于-80 ℃冰箱中預凍，次日于凍干機中凍干。取少量凍干粉，精密稱定，以超純水為溶劑，嚴格按照1 mg干粉∶1 mL水的比例進行配制，制成1 000 μg/mL的樣品溶液，0.22 μm濾膜濾過，所得濾液即供試品溶液。以該供試品為母液，超純水為溶劑，稀釋20倍，得到質量濃度為50 μg/mL的供試品溶液。

2.2.2 巴西蘇木素對照品溶液的制備 取巴西蘇木素對照品適量，精密稱定，以超純水為溶劑，嚴格按照1 mg對照品∶1 mL水的比例進行配制，制成質量濃度為1 000 μg/mL的樣品溶液，0.22 μm濾膜濾過，所得濾液即巴西蘇木素對照品溶液。以該溶液為母液，超純水為溶劑，稀釋250倍，得到質量濃度為4 μg/mL的巴西蘇木素對照品溶液。

2.2.3 原蘇木素B對照品溶液的制備 取原蘇木素B對照品適量，精密稱定，以超純水為溶劑，嚴格按照1 mg對照品∶1 mL水的比例進行配制，制成質量濃度1 000 μg/mL的樣品溶液，0.22 μm濾膜濾過，所得濾液即原蘇木素B對照品溶液。以該溶液為母液，超純水為溶劑，稀釋400倍，得到質量濃度為2.5 μg/mL的原蘇木素B對照品溶液。

2.3 線性關系的考察

分別取巴西蘇木素和原蘇木素B對照品溶液(質量濃度均為1 000 μg/mL)，以超純水為溶劑，稀釋2.5倍，得到質量濃度均為400 μg/mL的巴西蘇木素對照品溶液及原蘇木素B對照品溶液。再采用等倍稀釋的方法，稀釋制備成質量濃度均分別為400、100、25、12.5、3.13、1.56、0.78、0.39 μg/mL的系列巴西蘇木素對照品溶液和原蘇木素B對照品溶液。將以上質量濃度相同的2份對照品溶液進行等體積混合，最終得到質量濃度分別為200、50、12.5、6.25、1.56、0.78、0.39、0.195 μg/mL的8份混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，并記錄相應的色譜峰面積，進樣量均為10 μL。以對照品溶液質量濃度為橫坐標(X)，色譜峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線，進行線性回歸分析，得巴西蘇木素的線性回歸方程為Y巴西蘇木素=65.092X-6 500.7(R2=0.999 8)，原蘇木素B的線性回歸方程為Y原蘇木素B=31.167X-1 933.6(R2=0.999 8)，表明巴西蘇木素和原蘇木素B在0.195～200 μg/mL范圍內，均與各自的峰面積有良好的線性關系。

2.4 精密度試驗

取同一份供試品溶液(質量濃度為50 μg/mL)，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，重復進樣6次，每次進樣量均為10 μL，記錄相應的色譜峰面積，結果計算得巴西蘇木素和原蘇木素B的峰面積RSD值分別為0.46%、0.78%，表明方法精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取同一份供試品溶液(質量濃度為50 μg/mL)，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、3、6、12、24、36 h進樣，進樣量均為10 μL，記錄相應的色譜峰面積。結果計算得到巴西蘇木素和原蘇木素B的峰面積的RSD值分別為0.64%、1.73%，表明樣品中兩種成分巴西蘇木素和原蘇木素B在36 h內穩定。

2.6 重復性試驗

取同一批蘇木藥材，按“2.2.1”項下方法制備蘇木凍干粉，分6次精密稱定凍干粉適量，配制成質量濃度50 μg/mL的供試品溶液6份。按“2.1”項下色譜條件進樣分析，進樣量均為10 μL，記錄相應的色譜峰面積，計算巴西蘇木素和原蘇木素B的質量分數分別為8.16%、5.67%，RSD值分別為3.18%、3.47%，表明方法重復性好。

2.7 回收率試驗

精密稱定已知質量分數的蘇木水提液凍干粉6份，稀釋制備成質量濃度為50 μg/mL的供試品溶液。取以上干粉溶液1 000 μL，分別加入1 000 μL巴西蘇木素對照品溶液(4 μg/mL)及1 000 μL原蘇木素B對照品溶液(2.5 μg/mL)，得到供試品與2種對照品混合溶液(以各溶液濃度與體積的乘積計算含量，即每份樣品中，凍干粉質量為50 μg，巴西蘇木素質量為4 μg，原蘇木素B質量為2.5 μg)。按“2.1”項下色譜條件進樣分析，進樣量均為10 μL，記錄相應的色譜峰面積，計算回收率。結果得到巴西蘇木素的平均回收率為103.89%，RSD為1.26%，原蘇木素B的平均回收率為99.83%，RSD為1.87%，見表1，表明樣品處理方法可靠。

2.8 樣品的測定

取“2.2.1”項下的供試品溶液(質量濃度50 μg/mL)，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄相應的色譜峰面積，以峰面積和標準曲線計算質量分數。結果測得巴西蘇木素的質量分數為8.16%，RSD為3.18%(n=6)，原蘇木素B的質量分數為5.67%，RSD為3.47%(n=6)。從100 g蘇木粗粉中提取得到8.9 g蘇木凍干粉，通過換算可以得到巴西蘇木素和原蘇木素B在蘇木粗粉中的質量分數分別為0.726%、0.505%。

表1 巴西蘇木素和原蘇木素B的加樣回收率試驗結果

Table 1 Recovery results of brazilin and protosappanin B (n=6)

成分樣品中的量/μg加入量/μg測得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%巴西蘇4.224.08.32102.48103.891.26木素4.244.08.40103.893.954.08.19105.843.994.08.19104.943.974.08.11103.614.114.08.21102.62原蘇木2.892.55.42101.1399.831.87素B2.932.55.3898.062.712.55.23100.582.742.55.1897.712.802.55.2899.032.942.55.50102.49

3 討論

[13]的蘇木水提工藝并進行優化，確定采用索氏提取法，8倍水量浸泡，提取3次，每次1 h的方法進行提取，以制得的蘇木水提液凍干粉計算提取率，結果為8.9%，比文獻[13](提取2次，每次4.5 h，提取率為6.8%)提高了工作效率及提取率。由于水分的凍干并不影響樣品中化學成分的含量，因此本文將水提液制成了凍干粉，既提高了樣品的穩定性又方便保存，且配樣操作簡單，可以獲得特定濃度的供試品。本文結果中的巴西蘇木素和原蘇木素B在蘇木粗粉中的質量分數均大于0.5%，符合2010年版《中國藥典》蘇木含量測定項下要求。

超高效液相色譜(UPLC)與高效液相色譜(HPLC)的基本分離原理是一致的，本文在文獻[14]的蘇木HPLC分離條件的基礎上，參照文獻[12,15]報道的HPLC和UPLC的轉換公式進行條件摸索，得到了蘇木的UPLC分離條件，獲得了色譜柱類型、洗脫梯度、進樣體積、流速等相關參數。應用此條件，巴西蘇木素和原蘇木素B在7.5 min內即可分離，色譜峰分離度為3.45。由此可見，以HPLC方法為基礎開發UPLC方法已經在理論上得到豐富并具有可行性，對已開發HPLC方法的中藥的質量檢測方法升級具有指導意義。

本文建立的蘇木樣品UPLC檢測方法精密度高，穩定性、重復性良好，并體現了UPLC在中藥分析上快速、高效、低污染的明顯優勢，可為今后建立蘇木質量檢測方法新標準提供參考。

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(責任編輯：陳翔)

Determination of brazilin and protosappanin B in Sappan Lignum by UPLC

ZHOU Xianzhen1，CHEN Weiying2，LIU Bo2，GUO De′an2，3， ZHOU Yisheng1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmacetuicalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.GuangdongProvincialAcademyofChineseMedicalSciences,The2ndAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 3.ChineseAcademyofSciences,ShanghaiInstituteofMateriaMedica,ShanghaiResearchCenterforModernizationofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Objective To develop an UPLC method to determine brazilin and protosappanin B in aqueous extract ofSappanLignum. Method Brazilin and protosappanin B were analyzed by UPLC. An ACQUICTY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm) column was used with the mobile phase of methanol-water (0.2% glacial acetic acid) in gradient elution mode and it cost 7.5 minutes throughout the general courses. The column temperature was 40 ℃ with a flow rate of 0.3 mL/min and the detective wavelength was 280 nm.Each sample was injected by 10 μL. Results The results showed that the peaks of brazilin and protosappanin B were separated commendably at the same time. The chromatographic peak areas also had good linearity in a beamy range of 0.195-200 μg/mL (R2=0.999 8). The average recoveries of brazilin and protosappanin B were 103.89% (RSD=1.26%) and 99.83% (RSD=1.87%),respectively. Conclusions Compared to HPLC,it apparently promoted efficiency by UPLC in analyzing brazilin and protosappanin B ofSappanLignumwith higher sensitivity,which could provide a reference for the establishment of new determination standards ofSappanLignum.

UPLC;SappanLignum; brazilin; protosappanin B; determination

2016-09-28

國家自然科學基金青年基金項目(81202398)；廣東省科技計劃項目(2013B010102006,2014A020221035,2015A020211025)；廣東省中醫藥科學院中醫藥轉化醫學研究專項項目(YN2014ZHR209,YN2015MS03)；國家中醫藥管理局臨床基地科研專項項目(JDZX2015207)

周賢珍(1991—)，女，2014級碩士研究生，Email:1159391257@qq.com；通信作者：果德安(1962—)，男，教授，博士生導師，從事中藥質量控制及體內代謝研究，021-50271516,021-50272789，Email:daguo@simm.ac.cn；周毅生(1957—)，男，教授，碩士生導師，從事藥物新劑型及新技術研究，020-39352168，Email: yishzhou@aliyun.com。

時間：2016-12-05 11:44

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161205.1144.001.html

R927.1

A

1006-8783(2016)06-0729-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016092803