豬O型口蹄疫合成肽疫苗免疫效力的研究

魏 冰，陳文娟，李建軍，呂傳忠，任東興，陳 庚，付旭彬*

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308）

豬O型口蹄疫合成肽疫苗免疫效力的研究

魏 冰1，陳文娟1，李建軍1，呂傳忠2，任東興2，陳 庚2，付旭彬2*

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308）

為了解豬O型口蹄疫合成肽疫苗免疫28 d后是否能夠增強(qiáng)對(duì)易感仔豬的免疫效力，本研究將豬O型口蹄疫合成肽抗原乳化后按1頭份、1/3頭份和1/9頭份三組劑量分別免疫易感仔豬。在免疫第28 d檢測(cè)仔豬血清中的中和抗體滴度及攻毒保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)PD50。結(jié)果顯示：1頭份劑量組VP1抗體滴度最高達(dá)1:45，且顯著高于其他劑量組VP1抗體滴度（P<0.05）；1/3頭份劑量組VP1抗體滴度最高達(dá)1:22，1/9頭份劑量組VP1抗體滴度均為1:16，該兩組間無(wú)顯著差異（P>0.05）。豬O型口蹄疫合成肽疫苗能夠有效抵抗O/GX/09-7毒株和JMS毒株的侵襲，增強(qiáng)了易感仔豬對(duì)該兩種病毒的免疫保護(hù)力。

口蹄疫病毒；Th表位肽；疫苗免疫增強(qiáng)劑；合成肽疫苗；抗體滴度；攻毒保護(hù)

口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）是一類(lèi)小型RNA病毒，被定義為口蹄疫病毒屬。一經(jīng)發(fā)現(xiàn)口蹄疫疫情，按法律規(guī)定必須上報(bào)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）[1]，它給畜牧產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。免疫注射口蹄疫疫苗是公認(rèn)有效的預(yù)防口蹄疫病毒的方法之一，臨床上主要使用全病毒滅活疫苗和合成肽疫苗對(duì)易感動(dòng)物進(jìn)行防治。合成肽疫苗存在無(wú)須操作全病毒，安全性高，穩(wěn)定性好，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[2]，被人們認(rèn)為是一種安全、可靠的防治口蹄疫疫病的疫苗。然而，口蹄疫合成肽疫苗的免疫劑量、免疫效力以及有效保護(hù)率仍需通過(guò)相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)一步確定。

自1982年有學(xué)者提出一種新型口蹄疫疫苗[3]，即合成肽疫苗，F(xiàn)MDV的表位蛋白研究不斷深入，對(duì)于疫苗的免疫效力檢測(cè)方法也不斷更新。倪衛(wèi)忠等[4]對(duì)包括免疫球蛋白IgG、IgM等和免疫后VP1抗體滴度的檢測(cè)評(píng)價(jià)了口蹄疫病毒的免疫應(yīng)答成效。還有研究人員[5]通過(guò)血清細(xì)胞因子IFN-γ、CD8+T淋巴細(xì)胞、三種VP1的表達(dá)水平分別對(duì)比了兩種口蹄疫病毒合成肽疫苗的免疫效力。大量研究表明，口蹄疫合成肽疫苗對(duì)于口蹄疫的防治起到一定成效。至2014年，農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)了一類(lèi)合成肽疫苗成為新獸藥[6]。本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)O型口蹄疫合成肽疫苗的VP1抗體滴度及PD50，期望能為提升疫苗安全性，確保疫苗穩(wěn)定性，明確疫苗最佳免疫量提供一些參考。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及分組30只體重為40 kg左右的易感仔豬（FMDV中和抗體效價(jià)不高于1:8或ELISA抗體效價(jià)不高于1:8）。該批仔豬購(gòu)自云南省飼養(yǎng)散戶(hù)于云南省生物制品研制中心基地圈養(yǎng)，隨機(jī)分成A、B、C三組，每組10只，并用耳標(biāo)編號(hào)。

1.2檢驗(yàn)用毒株口蹄疫O型病毒（O/GX/09-7株）、口蹄疫O型病毒（JMS株）由云南省生物制品研制中心提供，攻毒試驗(yàn)于云南省生物制品研制中心P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3主要試驗(yàn)試劑和儀器豬O型口蹄疫合成肽抗原由瑞普生物技術(shù)股份有限公司提供；MONTANIDE ISA 61VG佐劑（批號(hào)：T30311)，購(gòu)自賽彼科（上海）特殊化學(xué)品有限公司；豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒（批號(hào)：2014092301），購(gòu)自上海優(yōu)耐特生物醫(yī)藥有限公司；酶標(biāo)檢測(cè)儀（Bio-RAD15146型），購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物免疫 將乳化后的豬O型口蹄疫合成肽抗原分別耳后根肌肉注射仔豬，根據(jù)中華人民共和國(guó)獸藥典半數(shù)保護(hù)量測(cè)定法通則分為：A組為1頭份劑量組（1.0 mL），B組為1/3頭份劑量組（0.33 mL），C組為1/9頭份劑量組（0.11 mL），免疫28 d后收集血清并攻毒[7]。

1.4.2 間接ELISA檢測(cè)血清VP1抗體 操作步驟嚴(yán)格按照上海優(yōu)耐特豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3 PD50檢測(cè) 接種后28 d，將每個(gè)劑量組分為兩小組，5頭/組進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，其中一組每頭豬耳根后肌肉注射2 mL毒價(jià)為103TCID50的/O/GX/09-7株乳鼠毒；另一組每頭豬耳根后肌肉注射2 mL毒價(jià)為103TCID50的JMS株乳鼠毒。連續(xù)觀察10 d。對(duì)照豬均應(yīng)至少有一蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍。免疫豬出現(xiàn)任何口蹄疫癥狀即判為不保護(hù)。出現(xiàn)發(fā)病豬后要及時(shí)進(jìn)行隔離。根據(jù)免疫豬的保護(hù)數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算被檢疫苗的PD50。即l g PD50=l g（高于50%劑量組）+距離比例 ×l g（高于50%劑量組）[8]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本試驗(yàn)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0進(jìn)行分析，統(tǒng)一表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SE），采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較組間差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1血清VVPP11抗體檢測(cè)結(jié)果采用間接ELISA方法檢測(cè)免疫仔豬28 d后的血清VP1抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，1頭份劑量組VP1抗體滴度最高達(dá)1:45；1/3頭份劑量組VP1抗體滴度最高達(dá)1:22；1/9頭份劑量組VP1抗體滴度均為1:16，且1頭份劑量組VP1抗體滴度顯著高于1/3頭份劑量組和1/9頭份劑量組（P＜0.05），詳見(jiàn)表1。

2.2PPDD5500檢測(cè)結(jié)果每個(gè)劑量組分兩組分別耳后肌肉注射2 mL O/GX/09-7株乳鼠毒和MS株乳鼠毒，連續(xù)觀察10 d后，試驗(yàn)結(jié)果顯示：攻O/GX/09-7株乳鼠毒的，1頭份劑量組保護(hù)率達(dá)4/5，1/3頭份劑量組保護(hù)率達(dá)5/5，1/9頭份劑量組保護(hù)率達(dá)2/5；攻MS株乳鼠毒的，1頭份劑量組保護(hù)率達(dá)5/5，1/3頭份劑量組保護(hù)率達(dá)5/5，1/9頭份劑量組保護(hù)率達(dá)5/ 5。攻O/GX/09-7株乳鼠毒后，PD50為10-0.8112頭份，即O型口蹄疫合成肽疫苗接種0.155頭份便可以使50%易感仔豬獲得保護(hù)，每頭份疫苗含6.45 PD50；攻JMS株乳鼠毒后，O型口蹄疫合成肽疫苗PD50為10-1.19頭份，即O型口蹄疫合成肽疫苗接種0.064頭份便可以使50%易感仔豬獲得保護(hù)，每頭份疫苗含15.59PD50，詳見(jiàn)表2。

表1 免疫仔豬血清抗體滴度Table1 Antibody of piglets in its serum after immunity

表2 仔豬免疫后攻毒PD50情況Table2 PD50of piglets after toxicity attack

3 討論

我國(guó)與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織評(píng)價(jià)疫苗效力最直接數(shù)據(jù)是病毒中和抗體檢測(cè)和動(dòng)物免疫保護(hù)力檢測(cè)[9]。本研究通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)免疫豬O型口蹄疫合成肽疫苗的仔豬血清進(jìn)行口蹄疫VP1抗體滴度檢測(cè)以及免疫后28 d攻毒試驗(yàn)檢測(cè)PD50，評(píng)價(jià)了本試驗(yàn)使用的豬O型口蹄疫合成肽疫苗的免疫效力。免疫28 d后，豬O型口蹄疫合成肽疫苗能夠顯著增加仔豬血清中VP1抗體滴度。通過(guò)對(duì)免疫了豬O型口蹄疫合成肽疫苗的仔豬進(jìn)行PD50檢測(cè)試驗(yàn)顯示，本試驗(yàn)所用豬O型口蹄疫合成肽疫苗對(duì)兩種毒株的免疫效力均大于6，且攻毒保護(hù)率結(jié)果理想，效力穩(wěn)定。其中，豬O型口蹄疫合成肽疫苗對(duì)JMS毒株的抵抗力尤為顯著。豬O型口蹄疫合成肽疫苗成功出世對(duì)口蹄疫疫苗的發(fā)展起到了很大的推動(dòng)作用，研究人員在新型口蹄疫防治方法的安全性、免疫效力和經(jīng)濟(jì)成本方面也取得進(jìn)步。趙利平等[10]通過(guò)對(duì)O型基因工程疫苗的免疫保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)行研究，得到該疫苗大于3的免疫效力，且為基因工程疫苗的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定研究基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)中合成肽疫苗的免疫效力大于6，在免疫保護(hù)率方面表現(xiàn)了比基因工程苗更好的優(yōu)越性，但合成肽疫苗的穩(wěn)定性仍需大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，離大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)仍存在一些問(wèn)題亟需解決。王繼華等[11]對(duì)現(xiàn)有O型口蹄疫滅活苗進(jìn)行超濾濃縮后免疫，最終進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，認(rèn)為濃縮抗原后可顯著提升牛口蹄疫O型、Asia-Ⅰ型二價(jià)滅活疫苗免疫效果。而本試驗(yàn)中的口蹄疫病毒合成肽系病毒表面的兩段主要氨基酸序列，結(jié)果中出現(xiàn)1頭份免疫劑量保護(hù)率小于1/3頭份免疫劑量保護(hù)率現(xiàn)象，分析可能與合成肽疫苗免疫最佳劑量并非越高越好有關(guān)，如若想達(dá)到更好的免疫效果和更高的PD50，建議嘗試抗原合成肽的濃縮純化等方式，其對(duì)野毒產(chǎn)生免疫保護(hù)的抗原量有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

該試驗(yàn)從獸藥典公認(rèn)的抗體水平和動(dòng)物免疫保護(hù)力方面證明瑞普生物技術(shù)股份有限公司提供的豬O型口蹄疫合成肽疫苗對(duì)O/GX/09-7株乳鼠毒和MS株乳鼠毒有一定的抵抗作用，能夠保護(hù)易感仔豬免受該兩種毒株侵襲，為口蹄疫疫苗的最佳免疫劑量提供參考。

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[2]馮俊吾，潘志榮.口蹄疫流行現(xiàn)狀的分析及防控措施[J].養(yǎng)殖技術(shù)，2008（3）：100-101.

[3]張伯澄.一種新型的口蹄疫疫苗——合成肽疫苗[J].獸醫(yī)科技雜志，1983.

[4]倪衛(wèi)忠，孫泉云.動(dòng)物對(duì)口蹄疫病毒的免疫應(yīng)答及口蹄疫疫苗的質(zhì)量評(píng)估[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（16）：273-274.

[5]Feng Shan Gao,Lei Feng,Qiang Zhang,et al. Immunogenicity of Two FMDV Nonameric Peptides Encapsulated in Liposomes in Mice and the Protective Efficacy in Guinea Pigs[J]. Plos One,2013,8(7)：1-9.

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[7]尹成杰.中國(guó)獸藥典[S].第三版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.2011：附錄7.

[8]郎洪武，王樂(lè)元，王家福，等.豬口蹄疫O型滅活疫苗PD50效檢攻毒劑量試驗(yàn)[J].中國(guó)獸藥雜志，2004，38（12）：9-10.

[9]李樂(lè)，信愛(ài)國(guó)，廖得芳，等.中和抗體滴度檢測(cè)口蹄疫疫苗效果的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（3）：231-235.

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[11]王繼華，邵明，施程洪，等.抗原濃縮純化工藝對(duì)口蹄疫滅活疫苗免疫效果評(píng)價(jià)[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，31（5）：684-686.

Research on the immune effection of Type-O Foot and Mouth Disease Synthetic Peptide Vaccine

Wei Bing1,Chen Wenjuan1,Li Jianjun1,Lv Chuanzhong2, Ren Dongxing2,Chen Geng2,Fu Xubin2*
（1.Animal Science and Animal Medicine College,Tianjin Agriculture University,Tianjin 300384; 2.Tianjin Ringpu Biological Technology co.,LTD,Tianjin 300308)

In order to study the immunity enhancement when imuned type-O Foot and Mouth Disease synthetic peptide vaccines for piglets after 28 d.The antigen peptides of type O Foot and Mouth Disease was divided into 1、1/3 and 1/9 doses per piglets after its emulsified.Detect the VP1 antibody of serum and PD50immunity protective test.The results show that VP1 antibody of 1 per piglets was significantly higher than other group(P<0.05),and its higest antibody titer was 1:45; VP1 antibody of 1/3 per piglets’higest antibody titer was 1:22 and VP1 antibody of 1/9 per piglets’higest antibody titer was 1:16;there were no significant differences between the latter two groups(P>0.05).The synthetic peptide vaccines of type O FMDV can effectively resist O/GX/09-7 strains and JMS strains,.It can enhance the susceptibility of the two kinds of piglets virus immune protection.

Foot-and-mouth disease virus;The epitope peptides;Immunopotentiator;Synthetic peptide vaccine;AAntibody titer;Protective efficacy

S852.659.6

B

1672-9692(2016)05-0009-04

2016-04-20

魏冰（1990-），女，碩士，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)。

付旭彬（1975-），男，碩士，研究員，技術(shù)發(fā)展部總監(jiān)，主要從事獸醫(yī)生物技術(shù)與疫苗研究。

畜禽用合成肽新型疫苗的國(guó)際合作研究。