刺五加多糖對白痢仔豬糞便大腸桿菌的抑菌效果研究

韓 杰，周子琳，許人驥

（1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，遼寧 沈陽 110866；2.中國環境監測總站，北京 100012）

刺五加多糖對白痢仔豬糞便大腸桿菌的抑菌效果研究

韓 杰1，周子琳1，許人驥2*

（1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，遼寧 沈陽 110866；2.中國環境監測總站，北京 100012）

本試驗采用紙片試驗法研究了刺五加多糖（ASPS）對黃白痢仔豬糞便中大腸桿菌的抑制作用。結果表明，ASPS對白痢仔豬糞便大腸桿菌有一定的抑制作用，640 mg/mL ASPS對大腸桿菌的抑制效果最明顯，最小抑菌濃度（MIC）為160 mg/mL。與氧氟沙星抑菌活性比較發現，160、320和640 mg/mL ASPS的抑菌能力分別約為氧氟沙星的30.65%、32.26%和35.28%。

刺五加多糖；仔豬；大腸桿菌；抑菌活性

仔豬白痢是由致病性大腸桿菌引起新生仔豬的一種急性傳染病，多發于一月齡的仔豬，發病率與死亡率相對較低，但會對仔豬的生長與發育造成嚴重的影響[1]。刺五加（Acanthopanax senticosus）又名西伯利亞人參、五加參、南五加皮和刺拐棒等，主要分布于我國的東北、華北地區和俄羅斯、朝鮮、日本等地[2]。其中，刺五加多糖（ASPS）是刺五加活性成分中含量最高、作用最廣泛的功能因子之一[3]。以往研究已經表明，刺五加多糖具有調節斷奶仔豬腸道微生物區系的作用[4]。但關于應用ASPS對仔豬白痢的影響研究還未見報道。本試驗研究ASPS對白痢仔豬糞便大腸桿菌的抑制作用，為應用ASPS預防和治療仔豬白痢提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1 白痢仔豬糞便 采自某豬場。

1.1.2 ASPS 采用水提醇沉法，將刺五加根置于55℃烘箱干燥、粉碎、過篩。取過篩后的刺五加根粉加蒸餾水煮沸3 h，重復提取3次，離心，合并上清液，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至1:1，然后在濃縮液中加入等體積10%三氯乙酸，反復震蕩，離心，加入3倍體積80%乙醇加熱攪拌提取2次，每次1 h，離心，合并兩次的沉淀物用丙酮洗滌，沉淀物經凍干后得到棕色粗ASPS。將ASPS粗品純化，用苯酚-硫酸法分析ASPS含量為92.7%。

1.1.3 鹽酸左氧氟沙星 由常州華生制藥有限公司生產。

1.2試驗方法

1.2.1 培養基的制備 牛肉膏培養基：取2.5 g牛肉膏、5 g蛋白胨、2.5 g氯化鈉和10 g瓊脂，用500 mL水稀釋并加熱煮沸至瓊脂完全溶解，用10%氫氧化鈉溶液或10%鹽酸溶液調節pH至7.2～7.6，并于121℃高壓滅菌20 min，備用。

肉湯培養基：取0.5 g牛肉膏、1 g蛋白胨、0.5g氯化鈉，用100 mL水稀釋并加熱煮沸完全溶解，用10%氫氧化鈉溶液或10%鹽酸溶液調節pH至7.2～7.6，并于121℃高壓滅菌20 min，備用。

1.2.2 白痢仔豬糞便中大腸桿菌的分離培養和鑒定用滅菌棉簽沾取白痢仔豬糞便，分別放入含5 mL肉湯培養基的試管中，于37℃恒溫培養箱中培養24 h。制作麥康凱培養基，將上述活化24 h后的試管取出，接種在麥康凱培養基上培養24 h，在麥康凱培養基上選出大腸桿菌菌群，接種在牛肉膏培養基上培養。之后利用糖發酵管生化試驗鑒定大腸桿菌，將在牛肉膏培養基上培養的大腸桿菌接種在糖發酵管中培養24 h，如果使葡萄糖，乳糖產氣，并由紫色變成色，即可以鑒定為大腸桿菌。

1.2.3 刺五加多糖最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用平板劃線法。在培養基上劃線培養細菌。配制100 mg/mL的ASPS溶液，用兩倍法稀釋ASPS溶液濃度，形成10、20、40、80、160、320、640 mg/mL等7個濃度梯度。采用濾紙片法，將浸泡于ASPS溶液中2 h的直徑為6 mm的滅菌濾紙片均勻放置于平板上，每平板放6片。然后將細菌平板置37℃培養24 h。

1.2.4 刺五加多糖的抑菌效果測定 采用與上述1.2.3相同的濾紙片法，測定各濃度ASPS的抑菌效果。游標卡尺測定抑菌圈直徑的大小，重復3次。

1.2.5 左氧氟沙星溶液對各種供試菌的抑菌效果配制1 mg/mL左氧氟沙星溶液。測定左氧氟沙星對各供試細菌的抑菌效果。無菌水做參照。方法同于1.2.4。

1.3數據的統計分析試驗數據經Excel 2003初步整理，然后利用SPSS 19.0統計軟件中的單因素方差分析（ANOVA）進行統計分析，采用Duncan氏法進行多重比較檢驗，數據結果表示為“平均值±標準誤”，P＜0.05時確定為差異顯著。

表1 刺五加多糖對大腸桿菌的最小抑菌濃度Table1 Minimum inhibitory concentration of Acanthopanax senticosus polysaccharide on fecal escherichia coli

2 結果與分析

2.1刺五加多糖對大腸桿菌最小抑菌濃度（MMIICC）的測定用二倍法稀釋多糖溶液，通過對抑菌圈直徑大小的變化測定ASPS的最小抑菌濃度。抑菌圈直徑為≤6 mm、6～8 mm、8～10 mm、≥10 mm依次用“-”、“+”、“++”、“+++”表示[5]。結果顯示，ASPS對白痢仔豬大腸桿菌的MIC為160 mg/mL，640 mg/mL ASPS對大腸桿菌的抑菌效果最明顯。

2.2刺五加多糖與氧氟沙星對大腸桿菌的抑菌效果比較以抑菌圈的有無及直徑大小為ASPS抑菌效果的測定指標，ASPS對白痢仔豬大腸桿菌的抑菌效果見表2。

表2 刺五加多糖與氧氟沙星對大腸桿菌的抑菌直徑（mm）Table2 Inhibitory diameter of Acanthopanax senticosus polysaccharide and levofloxacin on fecal escherichia coli

在有抑菌作用的160、320和640 mg/mL ASPS中，640 mg/mL ASPS對大腸桿菌的抑菌直徑最大，160 mg/mL ASPS對大腸桿菌的抑菌直徑最小，其抑菌效果隨著多糖濃度的升高而增強，即多糖濃度與抑菌效果呈正相關。

左氧氟沙星對大腸桿菌有較強的抑菌效果，160、320和640 mg/mL ASPS對白痢仔豬糞便大腸桿菌抑菌直徑與左氧氟沙星的抑菌直徑相比差異均不顯著（P＞0.05），但640 mg/mL ASPS的抑菌直徑比160和320 mg/mL ASPS的抑菌直徑顯著增加（P＜0.05）。將不同濃度的ASPS與1 mg/mL氧氟沙星的抑菌效果進行比較，氧氟沙星的抑菌效果顯著高于不同濃度的ASPS的抑菌效果（P＜0.05）。160、320和640 mg/mL ASPS的抑菌效果分別為氧氟沙星的30.65%、32.26%和35.28%，說明ASPS的抑菌效果雖不及氧氟沙星，但也具有較為明顯的抑菌效果。

3 討論

多糖類物質是所有生命有機體的重要組成部分，是生物體內除核酸和蛋白質以外的又一類重要的生物大分子[6]。本試驗中使用的ASPS是采用水提醇沉法從刺五加根中提取的活性物質，該法能最大程度的保護ASPS結構的完整性和活性。以往的研究表明，ASPS是具有抗炎、抗氧化、免疫調節等多種生物活性的刺五加水提物[7]；同時，很多研究也已經表明刺五加水提物能調節畜禽腸道內的微生物的種群和數量。如刺五加水提物能增加斷奶仔豬腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益微生物數量，減少大腸桿菌等有害微生物數量[8]；還能促進犢牛消化道內乳酸桿菌的繁殖[9]；飼料添加800 mg/kg ASPS能顯著提高斷奶仔豬糞便乳酸桿菌數量，降低大腸桿菌數量，對免疫應激仔豬糞便的上述菌株也具有相似的影響效果[10]。有報道指出，多糖調節動物體腸道內微生物種群的作用可能與其作為有益菌的生長的底物促進乳酸桿菌生長，從而競爭性抑制大腸桿菌的增殖，進而改善仔豬腸道微生態平衡的有關[11]。

本試驗對ASPS在體外對白痢仔豬糞便大腸桿菌的抑菌效果進行了研究發現，ASPS對白痢仔豬糞便大腸桿菌有一定的抑制作用，當ASPS濃度為160 mg/mL即有抑菌功能，當濃度升高至640 mg/mL時抑菌效果最好。與氧氟沙星的抑菌效果比較發現，640 mg/mL ASPS的抑菌功能約為氧氟沙星的1/2.9。刺五加是我國傳統中草藥，具有安全、無毒副作用的特點，與作為抗生素的氧氟沙星相比，在畜禽生產中使用對人體無毒副作用，不存在細菌耐藥性等問題，本研究為ASPS在畜禽生產中預防和治療仔豬白痢提供了試驗依據。

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Research on bacteriostatic efficacy of Acanthopanax senticosus polysaccharide on fecal escherichia coli in piglets with pullorum disease

Han Jie1,Zhou Zilin1,Xu Renji2*
(1.College of Animal Science&Veterinary Medicine,Shenyang Agricultural University,Liaoning Shenyang 110866; 2.National Centre of Environmental Monitoring,Beijing 100012.)

Bacteriostatic efficacy of Acanthopanax senticosus polysaccharide(ASPS)on fecal escherichia coli in piglets with pullorum disease was examined by filter experiment method.The results showed that there were certain inhibitory effect on fecal escherichia coli in piglets with pullorum disease by ASPS with the most obvious bacteriostatic efficacy of 640 mg/mL ASPS and minimum inhibitory concentration of 160 mg/mL ASPS.The bacteriostatic ability of ASPS dose in 160,320 and 640 mg/mL of were 30.65%,32.26%and 35.28%respectively compared with levofloxacin.

Acanthopanax senticosus polysaccharide;Piglet;Escherichia coli;Antimicrobial activity

S828.5 < class="emphasis_bold"> 文獻標識碼：B

B

1672-9692(2016)05-0005-04

2016-03-17

韓杰（1978-），女，講師，博士，研究方向為動物生理的營養調控。

許仁驥（1978-），副研究員，主要從事環境污染的生物調控研究。

2014遼寧省博士科研啟動基金計劃項目（20141061）。