小麥條銹菌泛肽-核糖體蛋白S27a基因的鑒定與表達分析

莊 華,成玉林,康振生

(1.西北農林科技大學 植物保護學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100;2.西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100)

小麥條銹菌泛肽-核糖體蛋白S27a基因的鑒定與表達分析

莊 華1,成玉林2,康振生1

(1.西北農林科技大學 植物保護學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100;2.西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100)

從小麥條銹菌吸器cDNA文庫中鑒定到一個泛肽-核糖體蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a,UBRS27a)基因，命名為PsUBRS27a。該基因開放閱讀框為480 bp，編碼包含159個氨基酸殘基的蛋白質，其氨基酸序列含有典型的UBRS27a蛋白所具有的ubiquitin 和Ribosomal_S27結構域；序列比對發現UBRS27a蛋白在不同物種中高度保守，但PsUBRS27a蛋白在進化上與柄銹菌屬的UBRS27a蛋白親緣關系最近；種內多態性分析發現PsUBRS27a基因在不同小麥條銹菌菌系中的序列非常保守，無核苷酸變化；實時熒光定量PCR 結果表明，PsUBRS27a基因在條銹菌侵染小麥過程中呈上調表達趨勢，高峰期為接種后168 h。關鍵詞 泛肽-核糖體蛋白S27a；PsUBRS27a；小麥條銹菌；實時熒光定量PCR；表達譜

泛肽-核糖體蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a, UBRPS27a)是泛肽和核糖體蛋白的融合蛋白，其N和C端分別含有一個ubiquitin(UB)結構域和Ribosomal_S27結構域，且兩端結構域在不同物種中高度保守[1]。在細胞中, UB的常見功能是參與細胞中蛋白質的選擇性降解, 而核糖體蛋白的常見功能是組裝成核糖體, 主導細胞中蛋白質的合成。越來越多的證據表明, 許多種核糖體蛋白除組成核糖體、參與蛋白質生物合成之外, 還具有其他功能，如參與復制、轉錄加工、修復、自體翻譯、細胞凋亡調控、以及正常細胞的惡性轉化及發育調控等[2-3]。然而，目前對UB和核糖體蛋白在植物病原菌中的作用了解很少。

由小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麥條銹病是農業生產上的一種重要真菌病害。生產上主要利用抗病品種來防治小麥條銹病，但由于小麥抗病品種容易隨著條銹菌致病性的不斷變異而喪失抗性，導致條銹病持續威脅著全球小麥生產和糧食安全。因此，解析小麥條銹菌的致病及其變異機制對開發新的持久防治小麥條銹病策略具有重要意義[4]。

小麥條銹菌屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)中的柄銹菌屬(Puccinia)。它屬于嚴格的活體營養型病原菌，只能于活的寄主植物上獲得營養，進行繁殖和完成生活史。和其他銹菌一樣，小麥條銹菌在侵染過程中能夠形成高度特化的侵染結構-吸器，通過吸器與寄主植物進行信息和能量的交流，對銹菌的致病性起著關鍵作用。利用親和層析法可將銹菌吸器從侵染植物中分離開來，之后將分離得到的吸器進行測序鑒定到銹菌吸器cDNA文庫[5-8]，而其中的一些基因被證實為銹菌關鍵的致病相關基因[9-10]。

本試驗從小麥條銹菌吸器cDNA文庫中鑒定到一個泛肽-核糖體蛋白S27a基因，并對該基因的序列和轉錄表達特征進行分析，明確該基因為候選的小麥條銹菌致病基因。研究結果為今后深入探究UBRS27a蛋白在小麥條銹菌致病性中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料，菌種以及培養條件

供試小麥品種為“水源11”，種植于10 cm的花盆中，放置于16 ℃溫室，16 h光照/8 h黑暗條件下培養。小麥條銹菌菌系包括CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4和PK-CDRD，在感病小麥品種“銘賢169”上隔離繁殖。

所用的大腸桿菌菌株JM109由西北農林科技大學植物保護學院植物免疫研究室提供，用LB培養基，37 ℃培養。

小麥條銹菌的接種與繁殖：首先用毛筆涂抹接種法[11]將新鮮的條銹菌夏孢子接種于小麥葉片；接著將接種植株放置于16 ℃黑暗保濕箱保濕24 h；之后將保濕過的接種植株移至16 ℃溫室培養14 d后就可開始收集新鮮夏孢子。

1.2 儀器與試劑

Gel DocTMXR凝膠成像系統(Bio-Rad)，7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)和SW-CY-2FB 超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)等常用儀器。

Biozol試劑(BioFluxTM)，反轉錄試劑盒(Thermo)，TransStart FastPfu DNA Polymerase (全式金公司)，TaqDNA polymerase (Thermo)，膠回收試劑盒(BioTeke)，pMD19-T Simple (Takara)，pGEM-T Easy(Promega)，質粒小量抽提試劑盒(OMEGA)等常用試劑。

1.3 RNA樣品的采集

為了明確基因在小麥條銹菌不同侵染階段的表達特征，選取新鮮夏孢子、萌發夏孢子以及接種小麥后的一系列時間取樣，每個樣品用錫箔紙包好，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，備用。采用Biozol 試劑(BioFlux)提取樣品的RNA，第一鏈cDNA 的合成按照Invitrogen 公司的M-MLV Reverse Transcriptase 試劑盒操作說明進行，反轉錄引物采用oligod(T)18。

1.4 序列分析及比對

蛋白的保守結構域用Pfam(http://pfam.xfam.org/)進行預測。其他物種的同源蛋白通過Blastp在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中比對。進化樹分析用MEGA5(http://www.megasoftware.net)軟件，多序列用DNAMAN軟件比對。

1.5 種內多態性分析

為了分析基因的種內序列多態性，比較其在7個不同小麥條銹菌菌系中的編碼區(ORF)序列，包括CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4和PK-CDRD。通過PCR擴增產物測序來得到該基因在這7個小麥條銹菌菌系中的序列。

1.6 實時熒光定量PCR 分析

根據PsUBRS27a的 cDNA 序列，利用Primer Preimer 5.0 設計特異的定量PCR 引物，并選用小麥條銹菌的延伸因子(elongation factor，EF)作為內參(表 1)。實時熒光定量PCR參照Guo等[12]方法。每個反應做3個重復，進行3次生物學重復，采用Delta Delta Ct 法[13]分析試驗數據，確定基因的相對表達量。

表1 文中所用引物

2 結果與分析

2.1 PsUBRS27a基因的基本特征

在己構建的小麥條銹菌吸器cDNA文庫[8]中獲得一個編碼潛在UBRPS27a蛋白的cDNA序列-PSTha15J12(GenBank number：GH737195.1)。將該cDNA序列于Broad Institute中的小麥條銹菌基因組(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/puccinia_group/ Blast.html)中Blastx比對發現，該cDNA所對應的小麥條銹菌基因號為PSTG_01817.1。通過PCR 克隆驗證，獲得該基因序列全長，與數據庫預測的序列一致，命名為PsUBRS27a。PsUBRS27a的開放閱讀框為480 bp，編碼包含159個氨基酸殘基的蛋白質，分析發現其氨基酸序列含有典型的UBRS27a蛋白所具有的ubiquitin 和Ribosomal_S27結構域(圖1)。序列比對發現不同物種的UBRS27a蛋白相似度非常高，達85%以上。然而，進化樹分析發現PsUBRS27a蛋白在進化上與柄銹菌屬的UBRS27a蛋白親緣關系最近(圖2)。

圖1 PsUBRS27a蛋白的結構特征

圖2 不同物種UBRS27a蛋白的進化樹分析

2.2PsUBRS27a基因的種內多態性分析

為了鑒定PsUBRS27a基因的種內序列多態性，在7個不同的小麥條銹菌菌系(CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、Su11-4和PK-CDRD)中比較它的編碼區序列。序列比對發現PsUBRS27a基因在不同小麥條銹菌菌系中的序列非常保守，無核苷酸變化。

2.3PsUBRS27a基因的轉錄表達特征

接下來用實時熒光定量PCR方法來明確PsUBRS27a基因在小麥條銹菌不同侵染階段的轉錄表達特征。和夏孢子階段相比，PsUBRS27a在條銹菌侵染小麥階段呈上調表達趨勢，其高峰期為接種后168 h(圖3)。這些結果表明PsUBRS27a基因在條銹菌侵染寄主小麥中誘導表達，因此有可能對小麥條銹菌的侵染和致病性具有貢獻。

3 討 論

泛肽-核糖體蛋白S27a是泛肽和核糖體蛋白的融合蛋白，跟蛋白質的合成與選擇性降解密切相關，然而目前關于植物病原菌泛肽-核糖體蛋白S27a的研究是一個空白。在本試驗中，通過對小麥條銹菌泛肽-核糖體蛋白S27a基因進行研究，證實泛肽-核糖體蛋白可能在小麥條銹菌致病性中起著重要作用，這填補了植物病原真菌關于泛肽-核糖體蛋白S27a研究的空白，為今后揭示泛肽-核糖體蛋白S27a在病菌致病性中的作用奠定基礎。

U.夏孢子 Urediniospores；GU.萌發夏孢子 Germinated urediniospores；18 h～216 h.接種CYR32后18 h～216 h的小麥樣品 18 hours-216 hours post inoculation with CYR32 in wheat; 數值代表3次生物學重復試驗的平均值±標準誤 Values are the average ± SD of three independent experiments.

本研究證實UBRS27a蛋白在不同物種中序列高度保守，之前也有類似文獻報道[14]。然而UBRS27a蛋白在不同物種中的功能是否高度保守目前不是很清楚。另外，PsUBRS27a基因被證實在不同小麥條銹菌菌系中序列非常保守，無核苷酸變化。種間和種內序列的高度保守性揭示UBRS27a蛋白在不同生物體(包括小麥條銹菌)中的重要作用。

實時熒光定量PCR試驗結果表明，PsUBRS27a基因在條銹菌侵染寄主小麥中誘導表達，且誘導表達倍數很高，最高可達50倍。這表明PsUBRS27a是一個候選的小麥條銹菌致病基因，對小麥條銹菌的侵染和致病性具有重要貢獻。考慮到PsUBRS27a從小麥條銹菌吸器cDNA文庫中鑒定，且PsUBRS27a的表達高峰期為接種后168 h，而該時期小麥條銹菌吸器大量形成，因此推測PsUBRS27a可能是通過影響吸器發育或功能從而參與小麥條銹菌的侵染和致病性。

今后，將通過多種方法來揭示PsUBRS27a基因在小麥條銹菌致病性中的具體作用，并深入探究其分子作用機制，這為最終解析小麥條銹菌的致病機制，及開發新的持久防治小麥條銹病策略，具有重要意義。

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(責任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Identification and Expression Analysis of an Ubiquitin-ribosomal Protein S27a Gene fromPucciniastriiformisf.sp.tritici

ZHUANG Hua1，CHENG Yulin2and KANG Zhensheng1

(1. College of Plant Protection, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling Shaanxi 712100, China；2. College of Life Sciences, Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100, China)

We identified an ubiquitin-ribosomal protein S27a gene (designatedPsUBRS27a) from the cDNA library of isolated haustoria ofPucciniastriiformisf. sp.tritici(Pst).PsUBRS27ahas an open reading frame of 480 bp that encodes a 159 aa protein whose N terminal and C terminal contain a ubiquitin domain and a ribosomal_S27 domain, respectively. Further sequence alignment revealed thatPsUBRS27aproteins are highly conserved in different organisms, but phylogenetic analysis indicated that thePsUBRS27aprotein is more closely related to UBRS27a proteins fromPucciniagroup. The intra-species polymorphism ofPsUBRS27awas studied and the results indicated thatPsUBRS27awas highly conserved in different Pst isolates and no single-nucleotide polymorphism was observed. qRT-PCR analysis showed that transcript level ofPsUBRS27awas induced in planta during Pst infection and was peaked at 168 hour post-inoculation. This study provides important theoretical basis for further studying of the role of UBRS27a in Pst pathogenicity.

Ubiquitin-ribosomal protein S27a;PsUBRS27a;Pucciniastriiformisf. sp.tritici; qRT-PCR; Expression profile

ZHUANG Hua, female,technician.Research area:immunology.E-mail:zhuanghuaok@nwsuaf.edu.cn

KANG Zhensheng, male,professor.Research area:immunology.E-mail:kangzs@nwsuaf.edu.cn

2016-08-16

2016-10-09

國家“973”計劃(2013CB127700)；高等學校學科創新引智計劃“111”(B07049)。

莊 華，女，實驗師，研究方向為植物免疫學。E-mail:zhuanghuaok@nwsuaf.edu.cn

康振生，男，教授，從事植物免疫學研究。E-mail:kangzs@nwsuaf.edu.cn

日期：2016-12-12

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1114.010.html

S432.1

A

1004-1389(2016)12-1775-05

Received 2016-08-16 Returned 2016-10-09

Foundation item National “973” program(No.2013CB127700)；the “111 ” Project from the Ministry of Education of China (No.B07049).