光源或培養基成分對金花茶愈傷組織中DFR、LAR與PPO基因表達及總兒茶素含量的影響

鐘春水， 賴瑞聯， 劉生財， 賴鐘雄

( 福建農林大學 園藝植物生物工程研究所， 福州 350002 )

光源或培養基成分對金花茶愈傷組織中DFR、LAR與PPO基因表達及總兒茶素含量的影響

鐘春水， 賴瑞聯， 劉生財， 賴鐘雄*

( 福建農林大學 園藝植物生物工程研究所， 福州 350002 )

該研究以富含兒茶素的金花茶愈傷組織為材料，對不同光源、激素、碳源及苯丙氨酸處理30 d的愈傷組織中DFR表達量、LAR表達量、PPO表達量與總兒茶素含量的變化情況及四者兩兩之間的相關性進行了分析。結果表明：這4個檢測項目均對以上處理有顯著的響應；在以上各因素處理下，DFR與LAR的表達模式十分相似，其相關系數處在0.710～0.889之間；在不同碳源處理下，PPO表達量與總兒茶素含量的變化呈顯著負相關關系，其相關系數為-0.696；在不同苯丙氨酸添加量處理下，DFR與LAR表達量變化均與總兒茶素含量變化呈顯著正相關關系，其相關系數分別為0.786和0.564；適宜兒茶素離體生產的金花茶愈傷組織增殖配方為附加4 mg·L-16-BA、0.6 mg·L-12,4-D、30 g·L-1蔗糖與0.660 8 g·L-1苯丙氨酸的MS固體培養基，其總兒茶素含量可達40.11 mg·g-1DW。以上研究表明，與茶樹相似，在金花茶中DFR與LAR在兒茶素代謝過程中密切相關；PPO表達量升高導致金花茶兒茶素損失；添加適宜濃度的苯丙氨酸作為前體物質是提高愈傷組織中總兒茶素含量的有效措施。

光， 激素， 碳源， 苯丙氨酸， 相關性分析

金花茶(Camellianitidissima)是一種藥用價值很高的木本花卉，其兒茶素具有抗氧化(Lu et al，2011 )、抗炎(Garcia et al，2013)和抑制克氏錐蟲生長等作用(Paveto et al，2004)。植物組織培養具有條件可控、性狀一致性好且增殖系數高的優勢(王蒂，2004)。因此，以植物組織培養為平臺，開展金花茶兒茶素代謝的分子機制的研究對于金花茶兒茶素深度開發具有重要意義。

DFR、LAR與PPO基因對于兒茶素的累積具有關鍵作用。其作用如下：DFR蛋白可逆地作用于正旋二氫槲皮素與二氫楊梅素且這個酶還參與了植物花青素的合成(Stafford & Lester，1985；Heller et al，1985； Fischer et al，2003)；LAR蛋白能夠催化兒茶素、無色花青素和相關的黃烷-3-羥基阿福豆素與沒食子兒茶素這些植物聚合型原花青素或者濃縮單寧合成起始物質的合成(Tanner & Kristiansen，1993；Tanner et al，2003)；PPO蛋白是一種含有3個銅的蛋白，這個蛋白專一地催化兒茶酚形成相對應的氧化醌且這個酶也對其他的取代型兒茶酚起作用(Gregory & Bendall，1967；Carsten et al，2002)。目前，國內外對于兒茶素代謝的分子機制研究主要集中在茶樹上(Yang et al，2012；Rani et al，2012；Hong et al，2014；Liu et al，2015)而在金花茶上僅有少量報道(Zhou et al，2012，2013)且未見金花茶LAR定量表達與相關性分析的研究報道。因此，該文以富含兒茶素的金花茶愈傷組織為材料對不同光源、激素、碳源及苯丙氨酸處理下DFR基因表達量、LAR基因表達量、PPO基因表達量與總兒茶素含量的變化及相關性進行了研究。希望通過以上試驗為金花茶兒茶素代謝的分子機制研究提供基礎并為金花茶兒茶素離體生產提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所需金花茶體細胞胚由福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供。采用MS+0.5 mg·L-1KT+8.0 mg·L-1NAA+5 mg·L-1AgNO3從上述金花茶體細胞胚上誘導愈傷組織(圖1：A)，并采用MS+4.0 mg·L-16-BA+0.6 mg·L-12,4-D以30 d為培養周期對獲得愈傷組織進行繼代增殖培養(圖1：B)。

1.2 金花茶愈傷組織的處理

1.2.1 不同光源處理 將愈傷組織接種在含4 mg·L-16-BA、0.6 mg·L-12,4-D和30 g·L-1蔗糖的MS固體培養基上，并分別置于LED紅、LED黃、LED藍、LED綠、LED白、LED暖白、黑暗或日光燈8種光下培養。若無特殊說明，所用培養基均以MS為基本培養基，pH均為5.8，經121 ℃、101 kPa高壓滅菌20 min保存備用，培養溫度為(25±2)℃，光源為日光燈，光照周期為12 h·d-1，培養時間為30 d，每個處理重復3次，下同。1.2.2 不同碳源種類與添加量處理 采用兩因素三水平的完全隨機試驗設計研究碳源種類(白糖、蔗糖、葡萄糖)與添加量(15、30、45 g·L-1)對DFR、LAR和PPO的表達量及總兒茶素含量的影響。其他培養基成分為4 mg·L-16-BA與0.6 mg·L-12,4-D。

1.2.3 不同6-BA與2,4-D濃度處理 采用兩因素三水平的完全隨機試驗設計研究6-BA濃度(3、4、5 mg·L-1)與2,4-D濃度(0.3、0.6、0.9 mg·L-1)對DFR、LAR和PPO的表達量及總兒茶素含量的影響。其他培養基成分為30 g·L-1蔗糖。

圖 1 富含兒茶素的金花茶愈傷組織誘導與培養 A. 從體胚誘導的愈傷組織；B. 繼代增殖的愈傷組織； C. 0.660 8 g·L-1苯丙氨酸處理下的愈傷組織。Fig. 1 Induction and culture of calli rich in catechins from Camellia nitidissima A. Calli induced from somatic embryo； B. Calli cultured in vitro； C. Calli treated under 0.660 8 g·L-1 PHE.

1.2.4不同苯丙氨酸添加量處理 將愈傷組織分別接種在含有0、0.082 6、0.165 2、0.330 4、0.660 8、1.321 5和2.643 0 g·L-1苯丙氨酸的7種MS固體培養基中置于日光燈下培養。其他培養基成分為4 mg·L-16-BA、0.6 mg·L-12,4-D 與30 g·L-1蔗糖。

1.3 金花茶DFR，LAR與PPO基因定量表達分析

1.3.1 金花茶RNA提取與逆轉錄 采用天根 RNA提取試劑盒(天根，北京)對以上不同光源、激素、碳源及苯丙氨酸添加量處理30 d后的金花茶愈傷組織進行總RNA提取。質量及濃度檢測合格后，采用TAKARA PrimerscriptTMRT Reagent Kit試劑盒進行RNA逆轉錄用于qPCR試驗。

1.3.2 qPCR引物、反應體系與反應程序 以18S為內參基因，根據文獻報道的DFR(周興文，2012)與PPO(FJ597757.1)及克隆獲得的LAR(KR045740.1)基因序列分別設計引物并送北京六合華大科技有限公司進行合成。反應體系與反應程序參照Lin & Lai(2002)報道的方法并根據相關引物TM值進行改良。各引物的序列及退火溫度見表1。

表 1 18S、DFR、LAR和PPO定量PCR所用引物及退火溫度

1.4 金花茶兒茶素總量測定

采用香莢蘭素法(魏毅等， 1999)對烘干至恒重且粉碎后過40目篩子的愈傷組織粉末進行兒茶素總量的測定。

1.5 數據分析

采用SPSS 19.0軟件對數據的方差、差異顯著性及相關性進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同光源處理下愈傷組織中DFR、LAR與PPO基因的表達量和總兒茶素含量變化及相關性分析

由表2可知，LED綠與日光燈處理下DFR表達量較高； LED紅、LED藍、LED綠、LED白及日光燈處理下LAR表達量較高；LED綠處理下PPO表達量較高；LED黃處理下總兒茶素含量較高。

表 2 不同光源處理下基因表達量及總兒茶素含量的測定

注： 不同小寫字母表示在0.05水平上有顯著差異。下同。

Note： Different lowercase letters mean having significant differences at 0.05 level. The same below.

方差分析結果表明，光對DFR、LAR和PPO這3個基因的表達及兒茶素總量均有極顯著影響。相關性分析結果表明，在不同光處理下，四項指標兩兩之間僅DFR與LAR之間存在顯著的相關關系且其相關系數為0.71。

2.2不同6-BA與2,4-D濃度處理下愈傷組織中DFR、LAR與PPO基因的表達量和總兒茶素含量變化及相關性分析

由表3可知，6-BA3+2,4-D0.3處理下DFR表達量較高；6-BA3+2,4-D0.3處理下LAR表達量較高；6-BA4+2,4-D0.3、6-BA4+2,4-D0.9及6-BA5+2,4-D0.9處理下PPO表達量較高；6-BA3+2,4-D0.6處理下總兒茶素含量最高且與其他八個處理存在顯著差異。

方差分析結果表明，6-BA、2,4-D及6-BA×2,4-D均對DFR、LAR與PPO基因這3個基因的表達及兒茶素總量存在極顯著影響。相關性分析結果表明，在不同6-BA與2,4-D濃度處理下，四項指標兩兩之間僅DFR與LAR之間存在顯著相關關系且其相關系數為0.889。

表 3 不同6-BA與2,4-D濃度處理下基因表達量及總兒茶素含量的測定

2.3 不同碳源種類與添加量處理下愈傷組織中DFR、LAR與PPO基因的表達量和總兒茶素含量變化及相關性分析

由表4可知，45 g·L-1蔗糖處理下DFR基因表達量相對較高； 45 g·L-1蔗糖處理下LAR基因表達量相對較高；15 g·L-1蔗糖或15 g·L-1葡萄糖處理下PPO基因表達量相對較高；30 g·L-1白糖處理下總兒茶素含量最高，均值為25.1 mg·g-1，且與其他8個處理均存在顯著差異。

方差分析結果表明，種類、添加量及種類×添加量均對DFR、LAR與PPO3個基因的表達及兒茶素總量存在極顯著影響。相關性分析結果表明，在不同碳源種類與添加量處理下，4項指標兩兩之間DFR與LAR之間存在極顯著正相關，其相關系數為0.867，且PPO與總兒茶素含量存在顯著負相關，其相關系數為-0.696。

2.4 不同苯丙氨酸添加量處理下DFR、LAR和PPO的表達量及總兒茶素含量變化及相關性分析

由表5可知，1.321 5或2.643 0 g·L-1苯丙氨酸處理下DFR基因表達量相對較高； 1.321 5或2.643 0 g·L-1苯丙氨酸處理下LAR基因表達量相對較高 0、0.082 6、0.165 2、0.330 4或2.643 0 g·L-1苯丙氨酸處理下的愈傷組織中PPO基因表達量相對較高； 2.643 04 g·L-1苯丙氨酸處理下的金花茶愈傷組織中總兒茶素含量最高，其均值為41.56 mg·g-1，且與其他7個處理存在顯著差異。

表 4 不同碳源種類與添加量處理下基因表達量及總兒茶素含量的測定

表 5 不同苯丙氨酸添加量處理下基因表達量及總兒茶素含量的測定

方差分析結果表明，苯丙氨酸添加量對DFR、LAR和PPO這3個基因的表達及兒茶素總量均有極顯著影響。相關性分析結果表明，在不同苯丙氨酸添加量處理下，四項指標兩兩之間DFR與LAR之間存在顯著正相關關系，其相關系數為0.861；DFR與總兒茶素含量存在極顯著正相關關系，其相關系數為0.786；LAR與總兒茶素含量存在極顯著正相關關系，其相關系數為0.564。

3 討論

3.1 在金花茶愈傷組織中DFR與LAR在兒茶素代謝過程中密切相關

在不同光照或培養基成分處理下DFR基因與LAR基因之間均存在顯著甚至極顯著正相關關系。換而言之，這兩個基因在這些情況下具有十分相似的表達調控模式。在茶樹中，DFR蛋白與LAR蛋白在進行催化反應時，前者的產物正是后者的底物(Hong et al，2014)，而且在葉片的酶學試驗中也發現了兩者之間有著不可分割的相關性((Punyasiri et al，2004)。

故由此推測：在金花茶中DFR蛋白與LAR蛋白在進行催化反應時前者的產物也是后者的底物且兩者在兒茶素物質轉化過程中密切相關。

3.2 PPO表達量升高導致金花茶愈傷組織中兒茶素損失

在不同碳源種類與添加量的處理下的愈傷組織中，PPO基因表達量與總兒茶素含量存在顯著負相關關系。當碳源為蔗糖15 g·L-1或葡萄糖15 g·L-1時，PPO基因的表達量尤其高而總兒茶素的含量尤其低。前人研究表明，PPO蛋白具有催化兒茶酚形成相對應的氧化醌的功能(Gregory & Bendall，1967；Carsten et al，2002)。

故由此推測，在不同碳源處理情況下個別處理總兒茶素含量顯著降低的現象可能是由PPO基因表達量顯著上升造成的。也就是說PPO表達量升高導致金花茶愈傷組織中兒茶素損失。

3.3 外源添加的苯丙氨酸通過提高金花茶愈傷組織中DFR與LAR等關鍵基因的表達從而促進兒茶素的積累

苯丙氨酸是類黃酮途徑物質合成的前體物質。在不同苯丙氨酸添加量處理下，DFR基因與LAR基因的相對表達量分別與總兒茶素總量存在極顯著正相關關系而在不同光、不同碳源種類與添加量或不同6-BA與2,4-D濃度處理下，DFR基因與LAR基因的相對表達量與含總量不存在顯著的相關關系。故此推測，在金花茶愈傷組織培養基中添加苯丙氨酸能夠起到作為兒茶素合成前體的作用且通過提高DFR與LAR等關鍵基因的表達從而提高愈傷組織中總兒茶素的含量。

綜合比較不同光源、激素、碳源及苯丙氨酸處理下愈傷組織中兒茶素含量，添加適宜濃度的苯丙氨酸是促進金花茶愈傷組織中總兒茶素累積更為有效的方式。

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Effects of light or medium components on gene expression ofDFR,LARandPPOand content of catechins in calli ofCamellianitidissima

ZHONG Chun-Shui, LAI Rui-Lian, LIU Sheng-Cai, LAI Zhong-Xiong*

( Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China )

Studies onCamelliasinensisshow that light and medium components had significant effects on metabolism of catechins in materials culturedinvitroand thatDFRgene,LARgene andPPOgene all have close relationship with it. For further study on molecular mechanism of metabolism of catechins and providing theoretical guidance for the deep development of catechins inC.nitidissima, calli rich in catechins were used as materials to study the variation ofDFRgene expression,LARgene expression,PPOgene expression and content of catechins and the correlation with each other in calli under different light source, hormones, carbon source or PHE treatments for 30 d. The results showed that all the above four detecting items reacted toinvitrotreatments significantly. Under the above treatments, the expression pattern ofDFRgene andLARgene was very similar. The correlation coefficients between the two under these treatments were between 0.710 and 0.889. The correlation ofPPOgene expression and content of catechins was significantly negative under different carbon source treatments and their correlation coefficient was -0.696.DFRgene expression was significantly positively related to the content of catechins under different PHE adding quantity treatments and the correlation coefficient was 0.786.LARgene expression was also significantly positively related to the content of catechins under different PHE adding quantity treatments and the correlation coefficient was 0.564. MS solid medium supplented with 4 mg·L-16-BA, 0.6 mg·L-12,4-D, 30 g·L-1sucrose and 0.660 8 g·L-1PHE was suitable forinvitroproduction of catechins. Content of catechins in calli cultured in this medium for 30 d was about 40.11 mg·g-1DW. Based on the above research we concluded that similar toC.sinensisthere was a close connection betweenDFRgene andLARgene during metabolism of catechins inC.nitidissimaand that the increase of expression ofPPOgene caused the loss of catechins inC.nitidissimaand that it was an effective way to add suitable amount of PHE for the increase of content of catechins in calli ofC.nitidissima.

light, hormone, carbon source, PHE, correlation analysis

10.11931/guihaia.gxzw201601015

2016-01-15

2016-03-31

福建省科技廳重大科技專項(2015NZ0002-1) [Supported by Major Science and Technology Projects of Fujian Provincial Science and Technology Department (2015NZ0002-1)]。

鐘春水(1990-)，男，福建龍巖人，碩士研究生，主要從事花卉生物技術研究，(E-mail)291768260@qq.com。

*通訊作者： 賴鐘雄，博士，研究員，主要從事園藝植物生物技術研究，(E-mail)Laizx01@163.com。

Q945，S685.14

A

1000-3142(2016)12-1410-06

鐘春水， 賴瑞聯， 劉生財， 等. 光源或培養基成分對金花茶愈傷組織中DFR、LAR與PPO基因表達及總兒茶素含量的影響 [J]. 廣西植物， 2016， 36(12):1410-1415

ZHONG CS, LAI RL, LIU SC， et al. Effects of light or medium components on gene expression ofDFR,LARandPPOand content of catechins in calli ofCamellianitidissima[J]. Guihaia， 2016， 36(12):1410-1415