加味宮外孕Ⅱ號方對早孕大鼠滋養細胞及肝臟的影響

鄭文蘭 楊江燕 文曉敏 陳歡歡

(1.貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州 貴陽 550002；2.綏陽縣中醫院， 貴州 綏陽 563300)

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加味宮外孕Ⅱ號方對早孕大鼠滋養細胞及肝臟的影響

鄭文蘭1楊江燕2文曉敏1陳歡歡1

(1.貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州 貴陽 550002；2.綏陽縣中醫院， 貴州 綏陽 563300)

目的 觀察加味宮外孕Ⅱ號方對早孕大鼠滋養細胞及肝臟的影響。方法 將早孕大鼠分為西藥組(甲氨蝶呤)、中藥(加味宮外孕Ⅱ號方)低、中、高劑量組、中西藥結合組和空白組(生理鹽水)，分別予甲氨蝶呤肌注、中藥或生理鹽水灌胃，第8天處死孕鼠取血、肝臟、子宮及孕囊，檢測血β-HCG,觀察滋養細胞及肝臟組織病理學改變。結果 與空白組比較，另5組出現滋養細胞結構異常、破壞，線粒體腫脹，核異染色質增多，炎細胞浸潤及血β-HCG下降，以中藥高劑量組和中西藥結合組較明顯，與其他3組比較差異有統計學意義(P<0.05)，中藥中劑量與低劑量組比較差異有統計學意義。除中藥低劑量組外，另外幾組孕鼠肝臟病理學評分上升，與空白組比較差異有統計學意義，西藥組和中西藥結合組上升明顯，與中藥高、中劑量組比較差異有統計學意義。結論 加味宮外孕Ⅱ號方通過影響孕鼠滋養細胞形態結構及功能而達到損壞胚胎目的，且存在量效關系，劑量增高作用增強；而對孕鼠肝損害較甲氨蝶呤輕。

加味宮外孕Ⅱ號方 早孕大鼠 滋養細胞 肝損害

異位妊娠(EP)是婦科常見的急腹癥，是孕產婦死亡的原因之一，發病率約2 %，病死率占孕婦死亡總數的9 %～10 %[1-2]，嚴重威脅育齡期婦女的生命安全及生殖功能。本院自2000年開始EP的藥物保守治療，經臨床實踐，篩選出一個相對穩定的中藥協定處方即加味宮外孕Ⅱ號方，其保守治療成功率86.7%[3]，廣泛應用于臨床17年，但其殺胚作用機理及對肝臟的影響尚不清楚。而輸卵管妊娠目前仍未能建立EP動物模型，故本研究以早孕大鼠為模型，探索該方對妊娠滋養葉細胞及肝臟的影響，以進一步探討其作用機制及副作用，間接為中醫藥保守治療EP提供科學的實驗依據。

1 資料與方法

1.1 動物

SPF級SD大鼠共110只，其中性成熟未生育雌性大鼠80只，體質量(260±10) g；性成熟雄性大鼠30只，體質量(280±10) g。由第三軍醫大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(渝)2012-0005。

1.2 藥物與試劑

加味宮外孕Ⅱ號方組成：丹參15 g、桃仁9 g、赤芍15 g、莪術9 g、三棱 9 g、全蝎10 g、土鱉蟲10 g、蜈蚣9 g、紫草25 g，以上中藥購于貴州省中醫院，由貴陽中醫學院制劑室制備成濃度為每毫升含生藥6 g(高劑量)、3 g(中劑量)、1.5 g(低劑量)的3種藥液，分別裝瓶標記，置于4 ℃冰箱冷藏備用；甲氨喋呤(MTX)由山西普德藥業有限公司生產，批號H14022462；HCG(絨毛膜促性腺激素)試劑盒由云南諾貝生物科技有限公司生產。

1.3 動物模型制備

造模方法參照《藥理實驗方法學》[4]：取雌鼠陰道分泌物作脫落細胞檢查，觀察2周，剔除無動情周期雌鼠16只，將雄鼠與動情期的雌鼠按1∶1比例合籠，次晨取雌鼠陰道分泌物鏡檢，查見精子為妊娠第1天。

1.4 動物分組與給藥

將交配成功的孕鼠隨機編號分為6組(每組8只)：西藥組、中西藥結合組和中藥低、中、高劑量組、空白組。經計算每只大鼠加味宮外孕Ⅱ號方給藥容積為0.777 mL/(100 g·d)，MTX給藥劑量為0.777 5 mg/100 g。給藥時間為上午09：00-10：00。

西藥組：妊娠第1天按0.777 5 mg/100 g體質量肌注MTX，1次為1個療程，以后不再給藥，并同時按0.777 mL/100 g體質量予生理鹽水灌胃，1次/d。中藥高、中、低劑量組：妊娠第1天起按0.777 mL/100 g體質量分別給予高、中、低劑量的加味宮外孕Ⅱ號方灌胃，1次/d。中西藥結合組：妊娠第1天起予中劑量加味宮外孕Ⅱ號方灌胃及MTX肌注。方法同西藥組及中藥組。空白組：妊娠第1天起按0.777 mL/100 g體質量予0.9%生理鹽水灌胃，1次/d。中藥及生理鹽水灌胃均連續用7 d。

1.5 標本收集與指標檢測

1.5.1 標本收集 用藥后第7天晚8點開始禁飲食，次晨8：00處死大鼠。同時取股動脈血5 mL，室溫下靜置1 h，以3 000r/min離心15 min，收集血清置-80 ℃冰箱備用。迅速取出大鼠肝臟及部分妊娠子宮,用4%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋HE染色作光鏡檢查用。將另一部分妊娠子宮切成大小為1 mm×1 mm的組織塊，放入2.5%戊二醛溶液中，固定24 h制片作電鏡檢查用。

1.5.2 檢測大鼠血β-HCG值 從冰箱中取出備用的血清并在室溫下解凍。采用ELISA法按HCG試劑盒說明書的方法測定孕鼠血清的HCG值。

1.5.3 孕鼠肝臟組織病理學檢查 肝臟組織病理學分級標準及評分參照文獻[5] 擬定：(1)肝細胞脂肪變性:包括大泡性脂變和小泡性脂變，無(-)；散在(+)；片狀病變<33%或限于肝腺泡Ⅲ區(++)；片狀病變33%～66%或達到肝腺泡Ⅱ區(+++)；彌漫性病變>66%或達到肝腺泡Ⅰ區(++++)。(2)肝小葉內炎癥、壞死：無(-)；散在小壞死灶(+)；片狀壞死灶(++)；大壞死灶，彌漫存在于肝小葉(+++)；橋接壞死(++++)。(3)纖維化：中央靜脈或匯管區周圍輕度纖維化(Ⅰ級)；中央靜脈間有纖維隔形成，但尚未連接成環(Ⅱ級)；中央靜脈間纖維隔相連成環形，匯管區位于其中央(Ⅲ級)；中央靜脈間纖維隔相連成環形，匯管區位于其中央，并且在中央靜脈和匯管區之間出現纖維隔(Ⅳ級)；病理評分標準:(-)記0分； (+、Ⅰ級)各記1分；(++、Ⅱ級)各記2分；(+++、Ⅲ級)各記3分；(++++、Ⅳ級)各記4分。以上3項合計為總評分。

1.5.4 滋養細胞及孕囊組織病理學評分標準 評分標準參照文獻[6] 擬定：0 分,胚囊及滋養細胞正常形態完全消失，無或少量壞死組織殘留； 1分,滋養細胞數量大量減少(90%)，部分胚囊及壞死組織殘留； 2分,滋養細胞數量減少(60%)，大量炎性細胞浸潤，胚囊正常形態破壞； 3分,滋養細胞數量減少(30%)，少量炎性細胞浸潤，胚囊完整； 4分,滋養細胞發育良好，胚囊完整。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 孕鼠肝臟組織病理學改變

甲氨蝶呤及中藥加味宮外孕Ⅱ號方均可使孕鼠肝臟出現不同程度的肝細胞水腫，脂肪空泡分布，匯管區、小葉中央靜脈和間質見炎細胞浸潤，纖維結締組織增生，肝臟組織病理學評分見表1。低劑量組與空白組、中劑量組與高劑量組、西藥組與中西藥結合組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

組別孕鼠數肝臟組織病理學評分分布/只0136912總評分空白組88000000.00±0西藥組80033116.00±3.2*■△中西藥結合組80034105.25±2.1*■□△中藥中劑量組81322002.63±2.3*▲△○中藥高劑量組80232104.00±2.8*▲△○中藥低劑量組86110000.50±1.7

注：與空白組比較，*P<0.05；與中劑量組比較，■P<0.05；與高劑量組比較，□P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05；與西藥組比較，▲P<0.05；與結合組比較，○P<0.05。

2.2 6組孕鼠血β-HCG變化

6組孕鼠的血β-HCG見表2，西藥組與中藥中劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

組別動物數/只β-HCG/(mIU/mL)空白組西藥組88 16.6±3.639.08±3.27*○□△中西藥結合組8 3.86±1.72*▲■□△中藥中劑量組8 8.55±4.10*□△○中藥高劑量組中藥低劑量組88 6.72±2.45*△▲○■ 11.47±4.29*▲○■□

注：與空白組比較，*P<0.05;與中劑量組比較，■P<0.05;與高劑量組比較，□P<0.05;與低劑量組比較，△P<0.05;與西藥組比較，▲P<0.05;與結合組比較,○P<0.05。

2.3 6組孕鼠妊娠滋養細胞病理評分

空白組滋養細胞形態正常，細胞排列整齊、體積正常、可見完整的胚囊組織；其他5組均出現不同程度的滋養細胞數量減少，結構不清、體積變小，炎細胞浸潤，胚囊的正常組織結構被破壞或消失，壞死組織殘留。見圖1。滋養細胞組織病理學評分西藥組和中藥中、低劑量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，中西藥結合組和中藥高劑量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

圖1 各組孕鼠妊娠滋養細胞組織病理學改變

組別孕鼠數滋養葉細胞病理評分分布01234評分空白組8000084.00±0西藥組中西藥結合組8815222120102.001±1.3*○□0.50±0.8*■△▲中藥中劑量組8221121.88±1.6*□○中藥高劑量組中藥低劑量組8830312302020.88±0.8*△■▲2.50±0.9*□○

注：與空白組比較，*P<0.05；與中劑量組比較，■P<0.05；與高劑量組比較，□P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05；與西藥組比較，▲P<0.05；與結合組比較，○P<0.05。

2.4 6組孕鼠滋養細胞超微結構觀察

空白組：核仁呈圓形，核膜界限清楚，核質內染色質均勻，胞漿內布滿正常細胞器；西藥組：細胞核無明顯異常，異染色質邊集于細胞膜，部分線粒體空泡化；結合組：細胞與細胞之間的間隙明顯較正常寬，可見不規則細胞核形狀，細胞核內布滿顏色較深的異染色質，并邊集于細胞膜，胞漿內細胞器較正常少，可見空泡化線粒體；中藥中劑量組：細胞核形狀較不規則，異染色質增多，線粒體腫脹；低劑量組：細胞核正常，線粒體腫脹；高劑量組：整個細胞腫脹，胞漿稀疏，線粒體腫脹，脊斷裂或消失。

3 討 論

中醫認為異位妊娠本質是血瘀少腹，其治則為活血殺胚消癥，本院所用加味宮外孕Ⅰ號方是在宮外孕Ⅱ號方(丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術)的基礎上加蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、紫草等。原方中丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術具活血化瘀消癥之功，而蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、紫草有破血、殺胚的作用,全方共奏活血殺胚消癥之效。MTX能干擾DNA、RNA及蛋白質合成和胚胎滋養細胞分裂,使胎盤、絨毛變性壞死、胚胎死亡，既往研究[7]認為甲氨蝶呤或中藥加味宮外孕Ⅱ號方均具有殺胚作用，但兩者合用殺胚效果更好[8]。屈云飛等[9]用MTX治療異位妊娠，肝毒性發生率為6.81%。從本研究結果看，滋養葉細胞的變化及血β-HCG下降在中西醫結合組及中藥高劑量組更明顯，提示當中藥劑量加大時殺胚作用增強，且能達到與中西藥結合組相似的效果。多年來，甲氨蝶呤廣泛用于治療異位妊娠，但治療后是否會增加下次妊娠胚胎的畸形或造成不良妊娠結局也是值得臨床醫師關注的問題。孫聞嘉等[10]研究發現甲氨蝶呤應用后廣泛分布于母體組織，在肝臟可持續蓄積達4個月之久，因此，在計劃妊娠前應停止使用甲氨蝶呤≥4 個月。本研究也發現甲氨蝶呤和中藥雖可造成孕鼠肝細胞水腫，脂肪空泡分布，匯管區、小葉中央靜脈和間質見炎性細胞浸潤，纖維結締組織增生；而中藥影響較輕。綜上所述，加味宮外孕Ⅱ號方可使孕鼠滋養葉細胞正常形態結構破壞，β-HCG分泌減少，妊娠不能維持，加之局部炎性細胞浸潤，導致胚胎組織發育停止并消亡。且隨劑量增加作用逐漸增強，但對肝臟的損害較西藥小。因此，在今后臨床中，對異位妊娠藥物保守治療的患者，為避免常規用甲氨蝶呤的副作用，我們是否可以首選中藥治療，并適當增加中藥的劑量。由于本研究所用模型為宮內妊娠的大鼠，結果存在一定的局限性，還需臨床大樣本、前瞻性、隨機隊列的進一步研究。

[1] 謝幸，茍文麗.婦產科學[M].8版. 北京:人民衛生出版社,2014:51.

[2] Berg CJ ,Atrash HK,Koonin LM,et al . Pregnancy-related morality in the United States[J] .Obstet Gynecol ,1996 ,88 (1) :161.

[3] 鄭文蘭，趙芳.米非司酮聯合中藥治療異位妊娠30例[J].四川中醫,2005,23(8):83.

[4] 徐淑云,卞職濂,陳修,等.藥理實驗方法學[M].2 版.北京:人民衛生出版社,1991:1313-1314.

[5] 房龍,馬安林，王遠新,等.茴三硫對大鼠酒精及四氯化碳致肝纖維化的防治作用[J].胃腸病學和肝病學雜志，2003，12(5)：429-432.

[6] 李霞.益母草堿對藥物致早孕大鼠不完全流產的影響及其部分機制的研究[D].安徽醫科大學，2009.

[7] 羅明靜. 甲氨喋呤聯合米菲司酮、中藥治療異位妊娠的療效觀察(附184例報告)[J]. 貴州醫藥, 2010, 34(6):525-526.

[8] 鄭文蘭，趙春梅,楊江燕.活血殺胚消癥法對早孕大鼠妊娠滋養細胞影響的實驗研究[J].云南中醫中藥雜志，2013,34(10):61.

[9] 屈云飛,余禎秀.MTX8日方案在異位妊娠保守治療的療效分析[J]. 西部醫學,2013,25(8):1228-1230.

[10]孫聞嘉，薛靜，吳華香.妊娠期和哺乳期女性免疫抑制藥的使用[J].臨床藥物治療雜志，2012,10(1):59.

讀者·作者·編者

醫學出版物中有效數字的確定

有效數字是指在實際測量中所能得到的有意義的數字。一個由有效數字構成的數值，只有末位數是估計數字，其余各位數字都必須是準確的。有效數字與測量儀器的靈敏度有關。以天平稱重為例，如果天平的靈敏度為0.1 mg,那么稱重結果16.14 mg為準確數字，0.04 mg為估計數字，兩項合在一起組成有效數字。平均值±標準差的位數，除了取決于測量儀器的精密度外，還取決于樣本內個體的變異，一般按標準差的三分之一來確定。如：(4.61±0.42)kg，標準差的三分之一為0.14，標準差波動在百克位，即小數點后第1位上，故應取到小數點后第一位，即(3.6±0.4)，過多的位數并無意義。但是在一系列數值并列時，小數點后的位數應一致。如在(3.61±0.42)、(5.86±0.73)、(2.34±0.15)這樣一組數據中，第3組數據標準差0.15的三分之一為0.05，在小數點后第2位，則該組數據的有效位數可均取到第2位。

貴州醫藥雜志社

Influence of trophoblast and liver of pregnancy rats with Chinese medicine which called the modified decoction Ⅱfor ectopic pregnancy.

ZhengWenlan1,YangJiangyan2,WenXiaomin1,ChenHuanhuan1.

1.TheFirstAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001，Guizhou,China. 2.SuiyangCountyHospital,Suiyang563300,Guizhou,China.

Objective To observe the influence of trophoblast cell and liver of pregnancy rats with the modified decoction Ⅱfor ectopic pregnancy. Methods The building successful pregnancy rats were randomly divided into the western medicine group (treat by methotrexate), the Chinese medicine group(The modified decoction Ⅱ for ectopic pregnancy low, medium, high dose), the combination of Chinese and western medicine group (treat by methotrexate and Party), and the blank group (saline).These groups were given an intramuscular injection with MTX, Party or saline was gavage once a day, for 7 days. On the eighth day of drug delivery, the rats were killed and taken the femoral arterial blood, livers, gravid uterus and gestational sacs, and measured the value of blood β-HCG, then observed the pathology change of trophoblast cells and liver tissue. Results Compared with the blank group, the other five treatment groups of trophoblast cells structure were damaged to varying degrees, mitochondria swelling, nucleus heterochromatin increased, inflammatory cells infiltration, the structure of embryo abnormalities and reduced blood β-HCG value. The changes in TCM high dose group and the combination of Chinese and western medicine group were more apparent. There were differences in comparison with the other three treatment groups(P<0.05). And there were differences in comparison with the TCM medium dose group and the low dose group. In addition to TCM low dose group, the other groups of pregnant rats liver pathology score rise, there were statistical significantly differences compared with the blank group. The score of western medicine group and the combination of Chinese and western medicine group increased significantly, which were differences compared with the TCM high and medium dose group.Conclusion Modified decoction Ⅱ for ectopic pregnancy destructed trophoblast morphological structure, reducing the amount of sertoli cell, normal physiological function damaged and achieve the goal of killing embryos. There is concentration-response relationship, dose, the higher the better, killing the embryos stronger, and traditional Chinese medicine (TCM)on pregnance rat liver damage is lighter than methotrexate.

The modified decoction Ⅱfor ectopic pregnancy； Pregnancy rats；Trophoblast; Liver damage

貴州省科技廳聯合基金[黔科合中藥字(2011)LKZ7041]

R714.22

A

1000-744X(2016)10-1032-04

2016-05-30)