理化因子對茶尺蠖核型多角體病毒活性的影響

譚榮榮，王友平，毛迎新，王佳璐

（1.湖北省農業科學院a.果樹茶葉研究所湖北省農業科技創新中心果茶分中心，b.植保土肥研究所，湖北武漢 430064；2.華中農業大學植物科學技術學院，湖北武漢 430070）

理化因子對茶尺蠖核型多角體病毒活性的影響

譚榮榮1a，王友平1b，毛迎新1a，王佳璐2*

（1.湖北省農業科學院a.果樹茶葉研究所湖北省農業科技創新中心果茶分中心，b.植保土肥研究所，湖北武漢 430064；2.華中農業大學植物科學技術學院，湖北武漢 430070）

研究了pH、溫度、紫外線和化學試劑處理對茶尺蠖核型多角體病毒活性的影響。結果表明，茶尺蠖核型多角體病毒在pH 7的環境中，活性最強，pH值升高或降低，茶尺蠖核型多角體病毒感染的茶尺蠖幼蟲的死亡率都會下降；當水浴溫度達80℃時，病毒幾乎完全失活；紫外線處理32 h可明顯降低病毒活性；在4種化學試劑中，0.1%CuSO4對病毒活力影響較小，經過乙醚和75%乙醇處理后的病毒活力有下降趨勢。

茶尺蠖核型多角體病毒；理化因子；病毒活性

茶尺蠖核型多角體病毒（Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，EoNPV）作為茶園主要害蟲茶尺蠖生物防治的重要手段之一，其優點是特異性強、穩定性好、安全無害，能引起害蟲群體病毒疾病的流行傳播，在相當長時間內可自然控制害蟲消長，導致相繼世代害蟲持續帶毒，感染死亡。然而昆蟲病毒在自然條件下，易受陽光、雨水及溫度等因素的影響，易于失活，殘效期不長，直接影響防治效果［1］。

測定EcobNPV在不同理化條件下的穩定性，不僅是其生理生化特性的一個重要方面，也是指導茶尺蠖大田防治的重要依據之一。本研究借鑒前人的方法和技術，以我國湖北茶園主要害蟲——茶尺蠖為材料，將部分純化的EcobNPV進行不同處理，再通過人工感染，測定EcobNPV在不同理化條件下的活性［2-3］。

1 材料與方法

1.1 茶尺蠖病毒懸液制備

茶尺蠖核型多角體病毒利用茶尺蠖幼蟲活體增殖，收集病毒感染致死的昆蟲尸體，用PBS緩沖液充分研磨后，4層紗布過濾，將濾液置于4℃條件下離心，500 r·m in-1離心5 m in，棄沉淀，上清液再用3 500 r·m in-1離心30 m in。然后用適量緩沖液重新懸浮沉淀，3 500 r·min-1離心30 min。差速離心反復進行多次，直至多角體懸液呈乳白色。病毒用血球計數板計數后，使用等體積PBS緩沖液稀釋，于4℃冰箱保存待用。本試驗中使用的茶尺蠖病毒水劑，病毒原液濃度為3.6×1010PIB· m L-1，使用終濃度為2×107PIB·m L-1。

1.2 供試蟲源與蟲齡

室內用茶樹鮮葉連續飼養6代以上的茶尺蠖幼蟲2齡期。

1.3 處理設計

pH對EcobNPV活性的影響。用0.2 mol·L-1的Na2HPO4和0.1 mol·L-1的檸檬酸按不同比例配置成pH分別為4、6、7、8的緩沖溶液，用HCl配置pH為2的溶液，用NaOH配置pH分別為10、12的溶液。用上述各pH值溶液稀釋病毒液至使用終濃度，將稀釋后的病毒液置于常溫下保存24、240 h后對茶枝葉片進行接毒，飼養茶尺蠖幼蟲。

溫度對EcobNPV活性的影響。將病毒原液稀釋至使用終濃度，盛于燒杯中，分別置于40、50、60、70、80、90、100℃水浴鍋中加熱，共7個處理。在加熱過程中用溫度計不斷攪拌病毒液并觀察溫度，待達到設定溫度時，使其保持恒溫30或60 min后取出冷卻供試。

紫外輻射對EcobNPV活性的影響。將涂有病毒多角體（病毒原液）的培養皿放在超凈工作臺中紫外燈管（30 W，波長為200～300 nm，最強處波長為255 nm）下進行輻射，設置60、120、240、480、960和1 920 m in 6個時間梯度處理，然后將處理過的病毒稀釋至使用終濃度待用。

化學試劑對EcobNPV活力的影響。用乙醚、乙醇、CuSO4和甲醛處理，具體處理方法如下：（1）將病毒原液分別用40倍體積的乙醚和75%乙醇靜置懸浮4 h，離心除去化學試劑后稀釋至使用濃度待用；（2）另取適量病毒原液用0.1%CuSO4稀釋至使用濃度后直接處理茶枝葉片；（3）直接取適量病毒原液用蒸餾水稀釋至所需濃度，然后甲醛熏蒸3 h對茶枝葉片進行接毒。

2 結果與分析

2.1 不同pH對EcobNPV致病力的影響

pH值升高或降低，對病毒的致病力均有較大影響（表1）。在酸性范圍內，隨著pH值的升高，幼蟲的感染率也隨之升高，當pH為4～6時，病毒致死率差異不顯著。堿性范圍內，隨著pH值的升高，對幼蟲的致病率顯著下降，pH 12條件下處理240 h，病毒幾乎完全失活。呂鴻聲［4］指出，中性溶液（pH值7）處理的病毒發病率最快，致病性最強，pH值升高或者降低都會影響病毒的感染率，延長潛育期。本研究中，pH值升高和降低均降低了EcobNPV的感染率，pH為6、7和8的溶液對EcobNPV的致病率無顯著影響。

表1 不同pH值對EcobNPV致病力的影響

2.2 溫度對EcobNPV致病力的影響

溫度是影響病毒變性的重要因素之一，溫度過高或處理時間過長會造成蛋白質變性，從而使病毒失活。隨著溫度的升高和處理時間的延長，病毒活性逐漸降低，感病幼蟲死亡率也逐漸降低。在處理溫度區域內，病毒活力受到不同程度的抑制作用，死亡率與CK（表1）相比明顯降低（圖1）。80℃水浴處理30 min，幼蟲仍有部分死亡，說明該病毒有部分保持了活力，對高溫耐受力較強。當溫度升至90℃時，EcobNPV完全失活。方差分析表明，60、70和80℃分別處理30 min，各處理之間的病毒致死率差異達極顯著水平；60、70和80℃分別處理60 min，各處理之間的病毒致死率差異也均達極顯著水平。

圖1 不同溫度下處理EcobNPV感染茶尺蠖幼蟲的死亡率

2.3 紫外線處理對EcobNPV致病力的影響

紫外線輻射對生物傷害或致死的主要原因是使有機體的遺傳物質DNA發生變化，從而造成遺傳變異或死亡。紫外輻射強度一定時，EcobNPV的活性與照射時間呈負相關，隨著照射時間的增長，EcobNPV的活性逐漸降低（表2）。EcobNPV經紫外線照射32 h后，飼毒幼蟲的死亡率僅為5.6%，病毒已幾乎完全喪失活性。

表2 紫外照射不同時間對EcobNPV致病力的影響

2.4 化學試劑對EcobNPV致病力的影響

不同化學試劑對EcobNPV活性的影響程度不一，但差異不大。0.1%CuSO4、乙醚、甲醛、75%乙醇對EcobNPV都沒有較強的滅活作用，處理后病毒液均保持較高的穩定性，其死亡高峰期也相對集中（表3）。能使蛋白質變性的甲醛未能使EgNPV喪失感染活性，致使處理幼蟲全部感染病毒死亡，這可能與病毒的外層囊膜結構有關。

表3 不同化學試劑對EcobNPV致病力的影響

3 小結與討論

作為昆蟲病原微生物，病毒在昆蟲疾病流行中起著十分重要的作用。因其具有對宿主專一性強、對環境友好等特性，日益為人們所重視，應用前景十分廣闊。環境中的各種生態因子，對昆蟲病毒的穩定性有明顯影響，因此，關于昆蟲病毒穩定性的研究是病毒生態學研究中的重要內容［4-7］。本文從pH值、溫度、紫外線和化學試劑處理4個方面對茶尺蠖核型多角體病毒的穩定性進行了研究，以期對昆蟲病毒流行學研究以及利用病毒制劑進行害蟲的持續控制提供依據。研究結果顯示，茶尺蠖核型多角體病毒（EcobNPV）對酸堿度和溫度有較寬的適應范圍，具有良好的穩定性；經紫外線和各種不同的化學試劑處理，也能保持較高的毒性。

溫度對病毒活性的影響主要表現在其宿主感染后的死亡率，隨著溫度的升高和處理時間的延長，病毒活性降低。茶尺蠖核型多角體病毒的穩定性受處理溫度和處理時間的共同作用，對一定時間的亞高溫（40～60℃）和短時（30 m in以內）的高溫（80℃以上）有一定的耐受性。

不同pH毒力影響試驗中，處理組幼蟲死亡特征為典型的桿狀病毒感染所致，病毒在pH 7的環境中活性最強，pH值升高或降低，病毒致病率都會下降；在pH值4和pH 6～8時，其感病幼蟲的死亡率沒有顯著性差異。由此可以得出，在pH值6～8時，EcobNPV的穩定性較高。

紫外線照射能使生物體內產生大量氧自由基，導致瞬時的或不可逆的細胞損傷。本試驗中，在適宜條件下（紫外線處理60 min），EcobNPV能至少保持感染活性數小時，然而隨著病毒接受紫外線積累量的增加，機體清除這些氧自由基的能力下降、抗氧化能力減弱造成細胞損傷，直至機體死亡。所以當輻射時間延長至32 h時，病毒失去活性。

EcobNPV對常用的化學試劑有較強的抵抗力。分別使用0.1%CuSO4、乙醚、甲醛和75%乙醇進行處理時，病毒仍保持較高的侵染力。可見在自然環境中，該病毒抗逆境的能力較強，普通的去污劑或蛋白質變性劑，均不能使EcobNPV完全滅活。

綜上所述，在茶尺蠖核型多角體病毒制劑的加工和野外施用過程中，應注意以下幾個問題：（1）在制劑加工過程中注意避免高溫環境［8］。水劑可忍受30 min內50℃以下的高溫環境，但最好不要超過40℃；（2）在低溫環境下保存病毒；（3）在使用時除注意應在低齡幼蟲期施用外，更應注意避免在高溫烈日下施用，夏季時可在清晨或傍晚進行施藥。

［1］ ERLANDSON M.Insect pest control by viruses［M］.Oxford：Academ ic Press，2008.

［2］ 殷燦.美國白蛾核型多角體病毒的穩定性研究［D］.泰安：山東農業大學，2014.

［3］ 殷燦，劉笛，任驥，等.溫度對美國白蛾核型多角體病毒活性的影響［J］.山東農業大學學報（自然科學版），2015，46（3）：353-356.

［4］ 呂鴻聲.昆蟲病毒與昆蟲病毒病［M］.北京：科學出版社，1982.

［5］ 孫新城，景建洲，陳小科.桿狀病毒的生態學和流行病學研究進展［J］.河南農業科學，2007（10）：16-18.

［6］ 孫修煉，胡志紅，彭輝銀.桿狀病毒生態學研究進展［J］. Virologica Sinica，2006，21（2）：200-206.

［7］ FUXA J R.Ecology of insect nucleo polyhedro viruses［J］. Agriculture，Ecosystems&Environment，2004，103（1）：27-43.

［8］ 殷坤山，陳華才，肖強，等.茶尺蠖核型多角體病毒制劑的試制與推廣應用［J］.中國病毒學（英文版），2000（S1）：84-87.

（責任編輯：侯春曉）

S476+.13

：A

：0528-9017（2016）12-2030-03

文獻著錄格式：譚榮榮，王友平，毛迎新，等.理化因子對茶尺蠖核型多角體病毒活性的影響［J］.浙江農業科學，2016，57（12）：2030-2032.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161232

2016-05-25

國家茶葉產業技術體系（CARS-23）；湖北省農業科技創新中心資助項目（2011-620-005-003-04）

譚榮榮（1981—），女，湖北襄陽人，碩士，助理研究員，從事茶樹植物保護研究工作，E-mail：tanrongrong1981 @163.com。

王佳璐（1980—），女，重慶人，博士，副教授，從事農業昆蟲與害蟲防治研究工作，E-mail：wangjialu@mail.hzau.edu.cn。