生物添加劑對羊草青貯飼料超微結構和纖維變化的影響

楊紅，張慶，侯建建，玉柱

(中國農業大學動物科技學院，北京 100193)

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生物添加劑對羊草青貯飼料超微結構和纖維變化的影響

楊紅，張慶，侯建建，玉柱*

(中國農業大學動物科技學院，北京 100193)

本試驗旨在研究纖維素酶和乳酸菌的單獨和復合添加對羊草青貯飼料超微結構和纖維組分的影響。將1060 U/g的纖維素酶(CEL)、1×105CFU/g的干酪乳桿菌(LC)、1060 U/g的纖維素酶和1×105CFU/g的干酪乳桿菌復合添加劑(LC+CEL)添加到羊草中經過切短后裝入0.5 L青貯桶中制作青貯飼料，每個處理3個重復。在常溫狀態下貯存45 d，測定發酵品質和營養品質變化并用透射電鏡觀察其超微結構。結果表明，混合組LC+CEL的pH為3.86顯著低于LC和CEL處理組(P<0.05)，乳酸和乙酸含量顯著高于LC和CEL處理組(P<0.05)。與對照組相比，LC+CEL處理組顯著降低43.9 g/kg的中性洗滌纖維、22.3 g/kg的酸性洗滌纖維、28.5 g/kg的纖維素和21.6 g/kg的半纖維素，增加20.5 g/kg的可溶性碳水化合物，29.2 g/kg乳酸。3個添加劑處理組中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均顯著低于對照組(P<0.05)，可溶性糖和有機酸含量顯著高于對照組(P<0.05)。總之，添加生物添加劑能破壞羊草的細胞結構，提供可溶性碳水化合物作為發酵底物，快速降低pH促進厭氧發酵。復合添加干酪乳酸菌和纖維素酶降解細胞壁和細胞內容物，將其轉化為可溶性糖和有機酸的效果最好，單獨添加干酪乳酸菌和單獨添加纖維素酶的效果次之。生物添加劑對羊草葉片不同部位和結構的細胞降解程度不同，羊草薄壁組織容易降解，木質化程度越高的厚壁細胞降解越困難。

羊草；細胞壁；生物添加劑；超微結構；纖維

羊草(Leymuschinensis)廣泛分布于中國松內平原和內蒙古高原的東部草原，是中國北方草原的優勢種[1]。羊草因其產量高、適應性強、適口性好，成為中國北方主要放牧和補飼牧草[2]。青貯與調制干草相比，技術路線簡單，對天氣依賴小，營養物質損失少，是理想的貯存羊草的方法。和大部分天然牧草一樣，羊草也具有纖維含量高而可溶性糖類物質含量低、緩沖能值高的特點，常規青貯很難迅速進入厭氧發酵階段，降低pH和達到理想的青貯效果較慢[3]。

生物添加劑有助于乳酸的快速產生，使青貯盡快到達厭氧發酵期[4]，因而廣泛應用于青貯飼料的調制過程中。纖維素酶能快速增加前20 h纖維素轉化成糖類的速度，增加發酵底物[5]，起到盡快降低pH的作用。Wang等[6]研究發現，添加外源纖維素酶能顯著改善大麥秸稈和苜蓿干草的體外消化率。乳酸菌在厭氧條件下發酵將可溶性碳水化合物轉化為以乳酸為主的有機酸，降低pH從而抑制有害微生物的活動，延長青貯飼料的保存時間[7]。劉丹[8]研究秸稈的化學添加劑預處理發現，化學處理能夠破壞薄壁組織，使維管束組織扭曲，加快薄壁組織、厚壁組織和維管束組織的韌皮部降解。然而生物添加劑處理對細胞結構的作用，尤其是羊草細胞壁未開展過研究。本試驗旨在探討生物添加劑處理后羊草青貯飼料細胞壁結構的變化，并尋找這種變化和營養成分變化之間的關系。

1 材料與方法

1.1 青貯原料和添加劑

青貯原料為中國農業大學沽源-豐寧野外國家試驗站天然草原野生生長的羊草，于2014年7月處于抽穗期刈割。添加劑：纖維素酶(cellulose enzyme, CEL)為固態的多組分酶系，由日本雪印公司生產，添加量為1060 U/g；干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，LC)由中國農業大學青貯研究室提供分離自新鮮羊草飼料的乳酸菌，添加量為1×105CFU/g鮮草。羊草青貯原料化學成分見表1。

表1 羊草青貯原料化學成分

Table 1 Chemical compositions ofL.chinensis

干物質DM(g/kg)可溶性碳水化合物WSC(g/kgDM)粗蛋白CP(g/kgDM)中性洗滌纖維NDF(g/kgDM)酸性洗滌纖維ADF(g/kgDM)半纖維素HC(g/kgDM)纖維素C(g/kgDM)酸性洗滌木質素ADL(g/kgDM)390.544.288.7574.7297.0277.8220.046.5

DM: Dry matter; WSC: Water soluble carbohydrate; CP: Crude protein; NDF: Neutral detergent fiber; ADF: Acid detergent fiber; HC: Hemicelluloses; C: Cellulose; ADL: Acid detergent lignin.

1.2 試驗設計與青貯制作

試驗設4個處理，分別為：添加量為1060 U/g的纖維素酶(CEL)；1×105CFU/g的干酪乳桿菌(LC)；復合添加劑1060 U/g的纖維素酶+1×105CFU/g的干酪乳桿菌(LC+CEL)；對照組為添加與處理組等量的蒸餾水。總計4個處理，每個處理重復3次。新鮮刈割的羊草原料切短至2 cm左右，稱取300 g裝入體積為0.5 L的青貯桶中，使青貯料的密度為600 kg/m3。于青貯第45天開封取樣進行分析。

1.3 樣品分析

依據楊勝[9]的方法測定各處理青貯飼料樣品的干物質(dry matter, DM)。按照Van Soest等[10]的洗滌纖維分析法測定中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)和酸性洗滌木質素(acid detergent lignin, ADL)的含量，并計算纖維素(cellulose, C)和半纖維素(hemicelluloses, HC)的含量。用凱氏定氮法測定粗蛋白(crude protein, CP)的含量[9]；采用蒽酮-硫酸比色法測定可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)含量[11]。

pH測定：取20 g青貯飼料鮮樣，加入180 mL蒸餾水，攪拌均勻，用組織搗碎機攪碎1 min，先后用4層紗布和定性濾紙過濾，得到浸出液，再用pH儀測定青貯飼料浸出液的pH[12]。使用SHIMADZE-10A型高效液相色譜分析乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid, AA)、丙酸(propionic acid, PA)和丁酸(butyric acid, BA)含量；色譜柱：Shodex Rspak Kc-811s-DVB gel Column 30 mm×8 mm，檢測器：SPD-M10AVP，流動相:3 mmol/L高氯酸，流速：1.0 mL/min，柱溫50 ℃，檢測波長210 nm，進樣量5 μL[13]。采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定氨態氮(ammonia nitrogen, NH3-N)含量[14]。

從LC+CEL處理組、LC處理組、對照組中各隨機取羊草青貯材料用于透射電鏡的觀察。選取第2節上葉片，距葉鞘3 cm并與葉脈垂直截取1.5～2.0 cm的葉片。重復取4～5片葉立即放入裝有2.5%戊二醛溶液的注射器中，來回抽氣多次至葉片懸浮于溶液中，后轉入離心管中室溫保存2 d以后4 ℃冰箱中保存。倒掉戊二醛固定液，然后用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，2%鋨酸溶液固定3 h，磷酸鹽緩沖液再洗3次，經各級乙醇脫水，進行常規樹脂包埋，在超薄切片機上用鉆石刀切片，再經醋酸鈾和枸椽酸鉛雙重染色，置于透射電鏡(Phillips Tecnai-12 TEM，荷蘭)下觀察，照相。

1.4 數據分析

用SPSS 19.0進行單因子方差分析，用Duncan法進行多重比較。以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 羊草青貯飼料發酵品質

各處理的發酵品質分析結果見表2，LC+CEL處理組的pH最低，LC處理組次之，都顯著低于對照組和CEL處理組(P<0.05)。混合組LC+CEL的pH 為3.86，顯著低于其他各組(P<0.05)，乳酸和乙酸含量分別為62.04和16.66 g/kg，顯著高于其他各組(P<0.05)。對照組、CEL處理組和LC處理組的乙酸含量沒有顯著差異。丁酸含量在各組之間不存在顯著差異。LC處理組的乳酸∶乙酸顯著高于對照組 (P<0.05)。LC和LC+CEL處理組的氨態氮含量顯著低于CEL處理組和對照組(P<0.05)。

表2 羊草青貯飼料的發酵品質

Table 2 Fermentation quality ofL.chinensissilage

發酵品質Fermentationquality對照CK纖維素酶CEL干酪乳桿菌LC干酪乳桿菌和纖維素酶LC+CELpH4.31±0.46a4.28±0.26a4.11±0.82b3.86±0.29c氨態氮NH3-N(g/kgTN)98.47±8.34a96.24±3.24a48.26±6.20b40.96±0.79b乳酸LA(g/kgDM)32.84±2.07c35.94±1.53c49.90±4.67b62.04±8.00a乙酸AA(g/kgDM)11.6±1.82b12.04±0.14b11.69±1.09b16.66±3.10a丙酸PA(g/kgDM)15.29±2.50a13.93±2.25a7.81±3.51b15.96±0.37a丁酸BA(g/kgDM)20.33±6.17a14.04±11.46a29.95±2.81a21.38±13.60a乳酸∶乙酸LA∶AA2.89±5.91b2.99±1.32ab4.28±4.52a3.86±10.98ab

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。
Note：The different letters within the same row mean the significant differences atP<0.05. The same below.

2.2 羊草青貯飼料細胞內碳水化合物組成

表3列出了羊草青貯飼料碳水化合物組成的變化。LC+CEL處理組中除ADL以外，NDF、ADF、纖維素、半纖維素和WSC含量均與對照組差異顯著(P<0.05)。NDF、ADF在LC+CEL處理組中含量最低，分別為545.1和285.3 g/kg；CEL組次之，3個處理組都顯著低于對照組 (P<0.05)。各處理組纖維素含量均顯著低于對照組 (P<0.05)，3個試驗組之間差異不顯著。LC+CEL處理組中半纖維素含量為259.8 g/kg，顯著低于其他各組(P<0.05)，羊草青貯飼料中WSC含量在LC+CEL處理組中最高，并顯著高于其他3組(P<0.05)；LC處理組的WSC含量顯著高于對照組(P<0.05)。

表3 羊草青貯飼料的營養成分組成

Table 3 Nutrient composition ofL.chinensissilage

營養成分Nutrientcomposition對照CK纖維素酶CEL干酪乳桿菌LC干酪乳桿菌和纖維素酶LC+CEL中性洗滌纖維NDF(g/kgDM)589.0±3.39a558.5±2.94c577.1±3.70b545.1±2.26d酸性洗滌纖維ADF(g/kgDM)307.6±6.14a288.1±2.15bc296.4±2.12b285.3±1.43c纖維素C(g/kgDM)261.7±1.89a226.5±0.57b234.2±0.29b233.2±0.35b半纖維素HC(g/kgDM)281.4±2.76a270.3±0.85b280.8±1.93a259.8±1.11c酸性洗滌木質素ADL(g/kgDM)47.8±2.56a53.2±0.52a48.6±1.29a49.7±2.65a可溶性糖WSC(g/kgDM)14.5±0.87c21.8±1.59bc24.8±1.89b35.0±3.75a

2.3.1 生物添加劑對羊草葉片薄壁細胞的影響 在透射電鏡下，對照組、LC處理組和LC+CEL處理組羊草葉片的薄壁細胞發生了不同程度的變化(圖1)。在2500倍透射電鏡下觀察到，對照組的羊草青貯飼料的薄壁細胞中存在大量易染色物質，細胞嚴重變形皺縮(圖1A)；LC處理組薄壁細胞內易染色物質較少，并且細胞腔變大，細胞膜與細胞壁之間空隙變小(圖1B)。LC+CEL處理組羊草青貯飼料的薄壁細胞中有極少的易染色物質，且觀察不到完整細胞結構(圖1C1)；在25000倍的透射電子顯微鏡下觀察到點狀或絮狀的薄壁細胞破壞后的細胞內容物(圖1C2)。

圖1 透射電子顯微鏡下羊草青貯飼料薄壁細胞的變化Fig.1 Changes of parenchyma cell transmission electron microscopy L. chinensis silage A: 對照組TEM 2500倍 Untreated TEM 2500 times; B: LC處理組TEM 2500倍 LC TEM 2500 times; C1: LC+CEL處理組TEM 2500倍LC and cellulose TEM 2500 times; C2: TEM 25000倍 TEM 25000 times.

2.3.2 生物添加劑對羊草葉片厚壁細胞形態的影響 從7000和8000倍透射電鏡圖片可知，對照組、LC處理組和LC+CEL處理組靠近表皮的厚壁細胞仍保持其原有形態，胞間層、初生壁和次生壁均保持其完整狀態。在25000倍透射電鏡觀察下，對照組的厚壁細胞細胞壁有明顯分層(圖2F1)，LC處理組的厚壁細胞細胞壁在靠近細胞液側有分層而在兩厚壁細胞交界處無明顯變化(圖2F2)。LC+CEL處理組細胞壁在25000倍透射電鏡下無明顯變化(圖2F3)。

進一步用透射電鏡將厚壁細胞放大至100000倍觀察，對照組、LC和LC+CEL處理組在靠近表皮側細胞壁有較厚的蠟質層。細胞壁中絲狀纖維延伸到蠟質層形成緊實的復合結構，角質層高度硅化(圖3)。

圖2 對照都、LC處理組和CEL+LC處理組厚壁細胞和厚壁細胞壁的變化Fig.2 Changes of sclerenchyma cell after treatments by untreated, cellulose, LC and cellulose E1：對照組TEM 8000倍 Untreated TEM 8000 times; E2：LC處理組TEM 7000倍LC TEM 7000 times; E3：CEL+LC處理組TEM 7000倍LC and cellulose TEM 7000 times; F1～F3: 對照組，LC處理組和CEL+LC處理組TEM 25000倍Untreated, LC, LC and cellulose TEM 25000 times.

圖3 對照組(G)、LC(H)和CEL+LC(I)處理組厚壁細胞壁的變化Fig.3 Changes of sclerenchyma cell after treatments by untreated(G)、LC(H) and LC+CEL(I) G～I: TEM 100000 倍 TEM 100000 times.

通過高倍的透射電子顯微鏡可以發現，厚壁細胞在靠近薄壁細胞側與遠離薄壁細胞側的細胞壁厚度不一致(圖4L～N)，遠離側厚于靠近側。厚壁組織與薄壁組織交界處的厚壁細胞內無明顯易染色物質積累。從100000倍透射電鏡圖片可知，LC處理組兩厚壁細胞細胞壁之間的胞間層有部分損壞(圖4P)，對照組(圖4O)無明顯變化；而LC+CEL處理組兩厚壁細胞細胞壁之間接觸面損壞程度遠大于LC處理組，胞間層結構不完整 (圖4Q)。

圖4 厚壁組織與薄壁組織交界處的厚壁細胞和厚壁細胞壁的變化Fig.4 Changes of cells and cell wall between the parenchyma cells and sclerenchyma cells L: 對照組TEM 5000倍Untreated TEM 5000 times; M: LC處理組 TEM 3500倍LC TEM 3500 times; N: CEL+LC處理組TEM 3000 LC and cellulose TEM 3000 times；O: LC處理組 TEM 100000倍LC TEM 100000 times; PQ: LC+CEL處理組 TEM 100000倍LC and cellulose TEM 100000 times.

3 討論

3.1 羊草青貯飼料發酵品質

羊草由于附著的乳酸菌較少，WSC含量較低，很難快速厭氧發酵并產生有機酸，降低pH[15]。乳酸和乙酸是青貯飼料中引起pH降低的主要原因。與其他試驗組相比，混合添加LC+CEL后羊草青貯飼料的pH和氨態氮含量最低，乳酸含量和乙酸含量最高。本試驗中混合添加乳酸菌和纖維素酶以后，增加了發酵初期乳酸菌的數量和發酵底物，使得乳酸菌大量繁殖并快速產生乳酸降低pH，有效地抑制了有害微生物的活動從而減少氨態氮產生。說明復合添加乳酸菌和纖維素酶的 LC+CEL處理組發酵品質明顯優于單獨添加乳酸菌的處理組和單獨添加纖維素酶的處理組。纖維素酶與乳酸菌之間的疊加效應可能是其效果好的原因[16]。

3.2 羊草青貯飼料細胞內碳水化合物組成與超微結構變化

在骨折后6 h內實施急診干預手術，患肢取仰臥位，經臂叢麻醉后上肢呈外展位，常規消毒、鋪無菌洞巾，在橈骨掌側、橈側做長約4～6 cm的縱形切口，切開筋膜，分離橈側腕屈肌和掌長肌，再鈍性分離肌肉、軟組織等，顯露骨折端，清除血腫后游離骨折端解剖標志線，整復骨折。再給予復位，放置鎖定T形板固定，注意保持骨折解剖力線和腕部的穩定性。在C型臂透視下可見復位滿意后，沖洗、縫合切口。

植物細胞由細胞質、細胞膜和細胞壁組成，細胞質和細胞膜中含有全部的可溶性糖，蛋白質、脂類和有機酸等，能夠完全被動物消化。植物細胞壁成分主要由纖維層和果膠組成[17]，包括纖維素，半纖維素、木質素和果膠等。成熟禾草的維管束包含初生木質部、次生木質部和非木質化的韌皮部。維管束外面為木質化的厚壁組織包圍[18]。牧草葉片組織結構的多樣性，是其降解特性差異的主要原因。比如，非木質化的薄壁細胞很容易降解，而木質化程度較高的厚壁細胞即使經過瘤胃微生物的作用也幾乎不被降解[19]。Moon等[20]研究發現，未添加青貯添加劑青貯以后，葉片的維管束組織和表皮細胞結構完整，氣孔和葉肉細胞內被破壞。

從各營養物質變化來看，不同處理組對羊草的處理效果有差異，干酪乳桿菌和纖維素酶復合添加更容易降解細胞中的營養物質，單獨添加干酪乳桿菌和單獨添加纖維素酶后降解效果減弱，單獨添加纖維素酶的效果低于單獨添加乳酸菌。復合添加干酪乳桿菌和纖維素酶，NDF，ADF，纖維素和半纖維素含量降低，可溶性糖含量增加。單獨添加干酪乳桿菌與纖維素酶，NDF, ADF, 纖維素和半纖維素含量降低更少，同時可溶性糖含量增加更少。進一步分析發現，添加干酪乳桿菌、纖維素酶、干酪乳桿菌和纖維素酶復合添加劑以后，不同程度的降解羊草組織細胞結構，導致各處理NDF、ADF、纖維素和半纖維素含量減少，而轉化為可溶性糖和乳酸等有機酸。處理后，更利于降解的WSC和有機酸含量增加，而結構復雜的NDF，ADF和半纖維素含量減少，這表明青貯過程中纖維被微生物降解為更易消化的可溶性糖和發酵產物有機酸。

生物添加劑對羊草內纖維不同部位和結構降解的程度不同，對薄壁組織降解最強烈，木質化程度越高的細胞降解越困難。最易被微生物降解的薄壁組織，在干酪乳桿菌和纖維素酶LC+CEL復合添加劑處理下已經觀察不到完整的細胞結構；LC單獨處理較對照組細胞壁變薄細胞腔變大；而對照組細胞結構完整，細胞壁皺縮細胞內有大量易染色物質存在。對照組在青貯以后薄壁細胞的變化與陳尚鈃等[21]發現酸類物質處理可以不同程度破壞纖維表面和細胞壁的結論一致。本試驗中，維管束組織附近的厚壁細胞木質化且細胞壁外有硅化的蠟質層，在各生物添加劑處理以后仍保持原有細胞結構。Akin等[22]、Engels 等[23]總結瘤胃中牧草莖稈的降解規律與細胞壁的關系中發現，厚壁細胞由于細胞壁分層，在瘤胃中也很難被微生物降解；次生細胞壁由于木質化不同只能部分降解，中層細胞壁由于木質素和纖維素結合成牢固的化學鍵不能被瘤胃微生物降解。LC單獨處理和復合添加LC+CEL，能使厚薄壁細胞鄰近的胞間層結構不完整僅有絲狀結構相連，并且復合添加處理的效果更好。生物添加劑對青貯過程中細胞壁的作用，對于提高牧草在瘤胃中的降解速度和改善消化具有促進作用。

4 結論

添加生物添加劑能破壞羊草的細胞結構，提供更充足的可溶性碳水化合物作為發酵底物，快速降低pH促進厭氧發酵。復合添加干酪乳酸菌和纖維素酶降解細胞壁和細胞內容物，將其轉化為可溶性糖和有機酸的效果最好，單獨添加干酪乳酸菌和單獨添加纖維素酶的效果次之。生物添加劑對羊草葉片不同部位和結構的細胞降解的程度不同，羊草莖的薄壁組織容易降解，木質化程度越高的厚壁細胞降解越困難。

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Effect of biological additives on ultrastructure and fiber content ofLeymuschinensissilage

YANG Hong, ZHANG Qing, HOU Jian-Jian, YU Zhu*

CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgricultureUniversity,Beijing100193,China

The aim of this study was to determine the effects of adding the cellulose (CEL) andLactobacilluscasei(LC) separately or together on the quality ofLeymuschinensissilage. ChoppedL.chinensiswas supplemented with 1060 U/g cellulose, 1×105CFU/g fresh matterL.casei, or both (LC+CEL). ChoppedL.chinensiswith no additives served as the control. Three replicates of each treatment were weighed and chopped into 0.5 L plastic buckets, and these mini silos were stored at ambient temperature for 45 days. The ultrastructure of stems, fermentation quality, and nutrient composition of theL.chinensissilage were analyzed. The pH in the LC+CEL mixture was 3.86, which was significantly lower than those in the LC and the CEL treatments (P<0.05), but the lactic acid and acetic acid contents in the LC+CEL mixture were significantly higher than those in the LC and the CEL treatments (P<0.05). The LC+CEL mixture showed significantly decreased neutral detergent fiber (43.9 g/kg), acid detergent fiber (22.3 g/kg), cellulose (28.5 g/kg), and hemicellulose (21.6 g/kg) contents, and increased water soluble carbohydrates (20.5 g/kg) and lactic acid (29.2 g/kg) contents after 45 days of fermentation. Compared with the control (no additives), all of the treatments showed significantly lower neutral detergent fiber and acid detergent fiber contents, and significantly higher water soluble carbohydrates and organic acids contents (P<0.05). Overall, the LC+CEL mixture performed better in terms of degrading fiber to water soluble carbohydrates and organic acids than did either LC or CEL, but all of the treatments performed better than the control. The biological additives degraded the different tissues to varying degrees, with greater degradation of parenchyma tissue and less degradation of lignified tissue.

Leymuschinensis; cell wall; biological additives; ultrastructure; fiber

10.11686/cyxb2016059

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-01；改回日期：2016-04-28

國家牧草產業技術體系(CARS-35)，公益性行業(農業)科研專項經費項目(201303061)，天津市農業科技成果轉化與推廣項目(201404040)和內蒙古自治區科技計劃項目(苜蓿混合青貯調制技術研究與示范)資助。

楊紅(1989-)，女，江蘇徐州人，在讀碩士。E-mail:yanghong1221@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: yuzhu3@sohu.com

楊紅, 張慶, 侯建建, 玉柱. 生物添加劑對羊草青貯飼料超微結構和纖維變化的影響. 草業學報, 2016, 25(12): 94-101.

YANG Hong, ZHANG Qing, HOU Jian-Jian, YU Zhu. Effect of biological additives on ultrastructure and fiber content ofLeymuschinensissilage. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(12): 94-101.