雷公藤內生真菌Pestalotiopsis disseminata次級代謝產物研究

李 博，王 宇，潘華奇，梁洪玥，趙 楠，陳再興，劉 濤

(1.中國醫科大學藥學院天然藥物化學教研室，遼寧 沈陽 110122；2.中國科學院沈陽應用生態研究所，遼寧沈陽 110016；3.錦州醫科大學藥學院，遼寧 錦州121000；4.中國醫科大學藥學院中心實驗室，遼寧 沈陽 110122)

雷公藤內生真菌Pestalotiopsis disseminata次級代謝產物研究

李 博1，王 宇1，潘華奇2，梁洪玥3，趙 楠1，陳再興4，劉 濤1

(1.中國醫科大學藥學院天然藥物化學教研室，遼寧 沈陽 110122；2.中國科學院沈陽應用生態研究所，遼寧沈陽 110016；3.錦州醫科大學藥學院，遼寧 錦州121000；4.中國醫科大學藥學院中心實驗室，遼寧 沈陽 110122)

采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜及PHPLC等手段對雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)內生真菌廣布擬盤多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的發酵次級代謝產物進行分離純化，通過理化性質及波譜學數據分析對化合物結構進行鑒定。結果表明，從內生真菌Pestalotiopsisdisseminata的次級代謝產物中共分離并鑒定了7個單體化合物，分別為7-羥基-5-甲氧基-4,6-二甲基苯酞(Ⅰ)、腺苷(Ⅱ)、尿苷(Ⅲ)、鄰苯二甲酸二正丁酯(Ⅳ)、鄰苯二甲酸二異丁酯(Ⅴ)、1,1′-二(1,1′-羧基乙基)醚(Ⅵ)、赤蘚醇(Ⅶ)，其中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ為首次從該屬真菌中分離得到，化合物Ⅰ、Ⅴ為首次從該種真菌中分離得到。

雷公藤；內生真菌；廣布擬盤多毛孢；次級代謝產物

植物內生菌是指在健康植物的組織和器官內部度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現任何癥狀的菌群，它們可能存在于植物組織內部的任何部位[1-2]，可以通過組織學方法從嚴格表面消毒的植物組織中分離，或者通過從植物組織內直接擴增出微生物DNA 的方法來獲得。藥用植物的內生真菌由于和藥用植物長期互惠共生，相互協調發展，往往可以產生一些與宿主植物自身代謝產物相同、相似或較為獨特的次級代謝產物，并且從這些較為獨特的次級代謝產物中往往更容易發現新的活性物質。目前，從藥用植物中已獲得了大量的內生真菌，有些內生真菌可以產生具有生物活性的天然產物(如喜樹堿[3-4]、紫杉醇及長春新堿等[5])，并表現出抗炎[6]、抗癌[7]、免疫抑制[8]及殺蟲[9]等多種生物功能。藥用植物內生真菌被認為是生物活性次級代謝產物的重要來源之一[10]。

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)又名黃藤、黃藤木、斷腸草等，為衛矛科一年生藤本植物，是我國傳統常用中藥。《中國藥用植物志》中記載：其味苦、澀，性寒、有毒，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗生育及免疫調節等藥理作用，臨床用于治療系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎[11]、腎炎等自身免疫性疾病[12]。然而，目前關于雷公藤的研究主要集中在化學成分的提取分離及臨床應用方面，有關雷公藤內生真菌的研究報道相對較少。

鑒于此，作者采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜及半制備型HPLC(PHPLC)等手段對雷公藤內生真菌廣布擬盤多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的發酵次級代謝產物進行研究，并對其結構進行鑒定，以期發現結構新穎的免疫抑制活性化合物。

1 實驗

1.1 菌種、試劑與儀器

雷公藤植株，2015年8月采自福建省寧德市柘榮縣，經遼寧中醫藥大學藥用植物學教研室許亮教授鑒定為雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)；實驗菌種分離自該雷公藤植株，經中國科學院沈陽應用生態研究所潘華奇助理研究員鑒定為廣布擬盤多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)真菌，存放于中國醫科大學藥學院天然藥物化學教研室。

Sephadex LH-20型凝膠，英國GE Healthcare 公司；HP-20型大孔吸附樹脂，日本三菱公司；柱色譜用硅膠G(100～200目、200～300目)和薄層色譜用硅膠GF254，青島海洋化工有限公司；常規用試劑均為分析純；高效液相色譜用試劑為色譜純。

AVANCE 600型核磁共振儀，德國Bruker公司；HITACHI 1110型半制備型高效液相色譜儀、1410型紫外檢測器，日本日立公司；EYELA N-1100型旋轉蒸發儀，日本東京理化器械株式會社；BSA124S型分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；HEQ-F160型振蕩培養箱，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；SW-CJ-1FD型凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；Sinochrom ODS-BP型色譜柱(10 mm×250 mm，5 μm)，大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發酵

將斜面保藏菌種接種到培養基平板上，28 ℃培養箱中培養3 d；然后將培養基平板切成小塊接種到裝有200 mL PDA發酵培養基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、150 r·min-1振蕩培養10 d，得到發酵液14.6 L。

PDA發酵培養基配制：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮后切成小塊，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過濾，在濾液中加入20 g葡萄糖，充分溶解后，分裝。

1.2.2 提取分離

將發酵液在8 000 r·min-1下離心15 min，分離菌絲體與發酵液。菌絲體用丙酮超聲提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓回收得到浸膏。發酵液用大孔吸附樹脂吸附后，依次用水、15%乙醇、95%乙醇進行梯度洗脫，收集95%乙醇洗脫液，減壓回收得到浸膏。合并上述兩部分浸膏得到粗浸膏53.8 g。粗浸膏經硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(體積比100∶0→0∶100)梯度洗脫，得到10個組分Fr.1～10。Fr.1(1.5 g)經硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(體積比100∶0→7∶3)梯度洗脫，得到組分Fr.1-1～5，其中Fr.1-3經PHPLC分離，用80%甲醇洗脫，進一步分離純化得到化合物Ⅳ(8.8 mg)和化合Ⅴ(10.4 mg)；Fr.1-5經PHPLC分離，用80%甲醇洗脫，進一步分離純化得到化合物Ⅰ(9.8 mg)。Fr.6(2.2 g)經硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(體積比15∶1→1∶1)梯度洗脫，得到組分Fr.6-1～6，其中Fr.6-6經PHPLC分離，用28%甲醇洗脫，進一步分離純化得到化合物Ⅶ(5.8 mg)和化合物Ⅲ(10.2 mg)。Fr.7(2.8 g)經Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，甲醇洗脫，得到組分Fr.7-1～6，其中Fr.7-6經PHPLC分離，用30%甲醇洗脫，進一步分離純化得到化合物Ⅱ(8.5 mg)。Fr.5(1.5 g)經甲醇反復重結晶得到化合物Ⅵ(20.1 mg)。

1.2.3 結構鑒定

通過理化性質及波譜學數據分析對化合物Ⅰ～Ⅶ進行結構鑒定。

2 結果與討論

從雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)內生真菌廣布擬盤多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的發酵次級代謝產物中共分離得到7個化合物，其理性質及波譜學數據如下：

化合物Ⅰ：無色針狀結晶(氯仿-甲醇)，10%硫酸乙醇顯灰紫色。1HNMR(CDCl3,600 MHz)，δ：7.68(1H,s,7-OH),5.20(2H,s,H-2),3.77(3H,s,5-OCH3),2.20(3H,s,6-CH3),2.14(3H,s,4-CH3);13CNMR(CDCl3,150 MHz)，δ：173.0(C-1),163.8(C-5),153.8(C-7),143.4(C-3),118.5(C-6),116.5(C-4),105.1(C-8),70.1(C-2),60.3(5-OCH3),11.4(4-CH3),8.5(6-CH3)。以上數據與文獻[13]基本一致，故確定該化合物為7-羥基-5-甲氧基-4,6-二甲基苯酞(7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalide)。

化合物Ⅱ：白色無定形粉末，紫外照射下有暗斑、無熒光。1HNMR(DMSO-d6，600 MHz)，δ：8.38(1H,s,H-2),8.17(1H,s,H-8),7.37(2H,brs,NH2),5.88(1H,d,J=6.0 Hz,H-1′),5.46(1H,s,H-2′),4.64(1H,brs,H-3′),4.17(1H,brs,H-4′),3.60(1H,d,J=12.0 Hz,H-5′a),3.58(1H,d,J=12.0 Hz,H-5′b)。以上數據與文獻[14]基本一致，故確定該化合物為腺苷 (adenosine)。

化合物Ⅲ：白色無定形粉末。1HNMR(DMSO-d6,600 MHz)，δ：11.33(1H,brs,NH),7.91(1H,d,J=8.4 Hz,H-6),5.81(1H,d,J=5.4 Hz H-1′),5.68(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),5.42(1H,brs,OH),5.13(2H,brs,OH),4.06(1H,t,J=6.6 Hz,H-2′),4.00(1H,t,J=6.6 Hz,H-3′),3.87(1H,dd,J=7.2 Hz、3.6 Hz,H-4′),3.65(1H,m,H-5′a),3.58(1H,m,H-5′b)；13CNMR(DMSO-d650 MHz)，δ：163.5(C-4),151.1(C-2),141.1(C-6),102.1(C-5),88.1(C-1′),85.2(C-4′),73.9(C-2′),70.3(C-3′),61.2(C-5′)。以上數據與文獻[15]基本一致，故確定該化合物為尿苷(uridine)。

化合物Ⅳ：無色油狀物。1HNMR(CDCl3，600 MHz)，δ：7.72(2H,m,H-3,6),7.53(2H,m,H-4,5),4.31(4H,t,J=7.2 Hz,H-1′,1″),1.72(4H,m,H-2′,2″),1.44(4H,m,H-3′,3″),0.96(6H,t,J=7.2 Hz,H-4′,4″)。根據δ7.72(2H,m)和δ7.53(2H,m)處呈現的峰形，推測該化合物可能具有鄰位對稱取代的苯環結構，構成AA′XX′自旋偶合系統。結合文獻[16]數據，確定該化合物為鄰苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate)。

化合物Ⅴ：無色油狀物。1HNMR(CDCl3，600 MHz)，δ：7.73(2H,m,H-3,6),7.54(2H,m,H-4,5),4.10(4H,d,J=6.6 Hz,H-1′,1″),2.04(2H,m,H-2′,2″),1.00(12H,d,J=6.6 Hz,H-3′,3″,4′,4″)。以上數據與文獻[16]基本一致，故確定該化合物為鄰苯二甲酸二異丁酯 (diisobutyl phthalate)。

化合物Ⅵ：白色無定形粉末，紫外照射下無暗斑、有熒光，10%硫酸乙醇不顯色。1HNMR(DMSO-d6，600 MHz)，δ：6.76(1H,brs,COOH),3.83(1H,brs,H-1,1′),1.22(3H,brs,H-2,2′)；13CNMR(DMSO-d6，150 MHz)，δ：177.1(COOH),68.3(C-1,1′),21.1(C-2,2′)。以上數據與文獻[17]基本一致，故確定該化合物為1,1′-二(1,1′-羧基乙基)醚[1,1′-bis(1,1′-carboxyethyl)ether]。

化合物Ⅶ：無色結晶(甲醇)。1HNMR(DMSO-d6,600 MHz)，δ：3.45(2H,m,H-2,3),3.35(4H,m,H-1,4)，均為連氧碳上的氫信號；13CNMR(DMSO-d6,150 MHz)中只有2個碳信號63.42和72.87，由此推測其可能為對稱結構。結合文獻[18]數據，確定該化合物為赤蘚醇(erthyritol)。

化合物Ⅰ～Ⅶ的結構式如圖1所示。

圖1 化合物Ⅰ～Ⅶ的結構式

3 結論

從雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)內生真菌廣布擬盤多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的發酵次級代謝產物中共分離得到7個化合物，分別為7-羥基-5-甲氧基-4,6-二甲基苯酞(Ⅰ)、腺苷(Ⅱ)、尿苷(Ⅲ)、鄰苯二甲酸二正丁酯(Ⅳ)、鄰苯二甲酸二異丁酯(Ⅴ)、1,1′-二(1,1′-羧基乙基)醚(Ⅵ)、赤蘚醇(Ⅶ)，其中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ為首次從該屬真菌中分離得到，化合物Ⅰ、Ⅴ為首次從該種真菌中分離得到。

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Secondary Metabolites of Endophytic Fungus Pestalotiopsis disseminata Isolated from ripterygium wilfordii Hook. f.

LI Bo1,WANG Yu1,PAN Hua-qi2,LIANG Hong-yue3,ZHAO Nan1,CHEN Zai-xing4,LIU Tao1

(1.DepartmentofNaturalProductsChemistry,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China;2.InstituteofAppliedEcology,ChineseAcademyofSciences,Shenyang110016,China;3.SchoolofPharmacy,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121000,China;4.CentralLaboratory,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China)

The secondary metabolites ofPestalotiopsisdisseminata,a endophytic fungus isolated fromTripterygiumwilfordiiHook.f.,were isolated and purified through silica gel and Sephadex LH-20 gel column chromatography as well as PHPLC method,and the structures of obtained compounds were identified by physicochemical properties and spectral data.Results showed that,seven compounds which isolated from the secondary metabolites ofPestalotiopsisdisseminatawere identified as 7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalide(Ⅰ),adenosine(Ⅱ),uridine(Ⅲ),dibutyl phthalate(Ⅳ),diisobutyl phthalate(Ⅴ),1,1′-bis(1,1′-carboxyethyl) ether(Ⅵ),erthyritol(Ⅶ),respectively.Compounds Ⅱ,Ⅲ,Ⅵ and Ⅶ were firstly obtained fromPestalotiopsisgenus,and compounds Ⅰ and Ⅴ were firstly found from fungusPestalotiopsisdisseminata.

TripterygiumwilfordiiHook.f.;endophytic fungus;Pestalotiopsisdisseminata;secondary metabolite

國家自然科學基金資助項目(81302672)，遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2013315)

2016-08-17

李博(1987-)，女，遼寧沈陽人，講師，研究方向：中藥及天然藥物活性成分和質量控制，E-mail:libo06101409@126.com；通訊作者：劉濤，副教授，E-mail:taoliu0307@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.005

李博，王宇，潘華奇，等.雷公藤內生真菌Pestalotiopsisdisseminata次級代謝產物研究[J].化學與生物工程，2016，33(12)：27-30.

R 284.1

A

1672-5425(2016)12-0027-04