腺苷A2A受體拮抗劑SCH58261減輕胎兔缺氧缺血性腦損傷*

柳艷麗， 唐震海， 王能里， 林振浪

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院新生兒科， 浙江 溫州 325027)

腺苷A2A受體拮抗劑SCH58261減輕胎兔缺氧缺血性腦損傷*

柳艷麗， 唐震海， 王能里， 林振浪△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院新生兒科， 浙江 溫州 325027)

目的： 研究腺苷A2A受體拮抗劑SCH58261減輕成熟胎兔缺氧缺血性腦損傷的作用。方法:選擇孕29 d的普通級(jí)新西蘭孕白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)、缺氧缺血組(HI組)、SCH58261 0.04 mg/kg劑量組、SCH58261 0.12 mg/kg劑量組和藥物溶劑組(DMSO組)。制備胎兔缺氧缺血性腦損傷模型，孕兔均在術(shù)后24 h行剖宮產(chǎn)，將存活新生兔置入已提前預(yù)熱為35 ℃的嬰兒暖箱內(nèi)保暖。記錄新生兔的一般狀況；評(píng)估存活新生兔神經(jīng)行為學(xué)改變；利用質(zhì)譜法測孕兔血清、新生兔血清及腦組織的SCH58261濃度；采用real-time PCR檢測新生兔腦組織皮質(zhì)、海馬和紋狀體區(qū)Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)；利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測新生兔腦組織皮質(zhì)、海馬和紋狀體區(qū)p-P38 MAPK的蛋白水平。結(jié)果:新生兔血清和腦組織中均能檢測到SCH58261的存在。與HI組比較，SCH 0.04 mg/kg組和SCH 0.12 mg/kg組新生兔腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體區(qū)Bcl-2 的mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)，而Bax的mRNA的表達(dá)均減少(P<0.05)。將p-P38 MAPK在新生兔腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體區(qū)的表達(dá)水平進(jìn)行比較，SCH 0.04 mg/kg組和SCH 0.12 mg/kg組的P38 MAPK磷酸化水平均低于HI組(P<0.05)，且SCH 0.12 mg/kg組與SCH 0.04 mg/kg組相比稍降低(P<0.05)。結(jié)論:腺苷A2A受體拮抗劑SCH58261可能通過阻斷腺苷A2A受體，抑制神經(jīng)元P38 MAPK的磷酸化，進(jìn)一步抑制腦細(xì)胞凋亡而減輕宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷。

A2A腺苷受體拮抗劑； 缺氧缺血性腦損傷； 圍產(chǎn)期

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是指由于圍生期窒息缺氧引起腦組織缺氧缺血性損害，在缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)的病因中，由宮內(nèi)窒息引起者占50%，娩出過程中窒息占40%，先天疾病所致者占10%[1]。然而對(duì)于HIE，目前仍缺乏極其有效的治療措施，亞低溫被認(rèn)為是目前唯一有效的治療方法；而臨床研究表明僅在生后6 h內(nèi)開始使用亞低溫對(duì)中度HIBD有效[2]。本研究前期已經(jīng)建立近足月胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型，其通過暫時(shí)性阻斷孕兔子宮血供造成胎兔宮內(nèi)缺氧缺血，很好地模擬了宮內(nèi)窒息的臨床過程，屬胎兒期全身性缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型[3]。新生兒腦損傷包括線粒體損傷、細(xì)胞凋亡及第三階段損傷，其中線粒體功能損傷繼發(fā)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為在未成熟腦神經(jīng)細(xì)胞死亡中起主導(dǎo)作用[4]。而Bcl-2、Bax在HIBD對(duì)未成熟腦后皮質(zhì)、海馬及紋狀體區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程中扮演重要角色[5]。當(dāng)腦缺血發(fā)生后，神經(jīng)元細(xì)胞A2A受體表達(dá)水平明顯提高[6]，細(xì)胞外腺苷濃度水平顯著提高，升高的腺苷作為一種重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，與腺苷受體(adenosine receptor，AR)A1AR、A2AAR、A2BAR及A3AR結(jié)合，特別是內(nèi)源性A2AAR的激活，主要通過早期刺激谷氨酸釋放、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥因子如COX-2、PGE2等的釋放，及負(fù)性調(diào)控NF-κB 路徑和P38促分裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase，P38 MAPK)路徑，加重缺血性腦損傷[7]。本研究利用新西蘭孕白兔建立胎兔宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型，在缺氧缺血后即刻，給予A2A腺苷受體拮抗劑SCH58261(SCH)，觀察胎兔腦組織凋亡基因的表達(dá)及P38 MAPK磷酸化的改變，為臨床HIE防治提供新方法。

材 料 和 方 法

1 分組及動(dòng)物模型制備

孕29 d健康新西蘭白兔23只，體重為3.7～4.5 kg，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK(滬)2007-0005。飼養(yǎng)條件為室溫20℃，相對(duì)濕度40%～60%。其中20只按照隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)(sham operated，SO)組、缺氧缺血(hypoxic-ischemic，HI)組、SCH 0.04 mg/kg組、SCH 0.12 mg/kg組和藥物溶劑組(DMSO組),每組4只。另外3只普通級(jí)新西蘭孕白兔，缺氧缺血后即刻予SCH58261 0.04 mg/kg用于檢測孕兔血清、新生兔血清和腦組織的SCH58261濃度。采用全身麻醉和腰麻的方法對(duì)孕兔進(jìn)行麻醉，全身麻醉誘導(dǎo)階段混合溶液速度為7.5 mL·kg-1·h-1，其中枸櫞酸芬太尼為0.075 mg·kg-1·h-1，氟哌利多為3.75 mg·kg-1·h-1，用生理鹽水混合后沿耳緣靜脈泵入；全身麻醉維持階段混合溶液速度為2.5～5 mL·kg-1·h-1，枸櫞酸芬太尼0.025～0.05 mg·kg-1·h-1，氟哌利多1.25～2.5 mg·kg-1·h-1；腰麻為向蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)注入0.25%鹽酸布比卡因0.3～0.5 mL，當(dāng)孕兔后肢完全放松表示麻醉成功。從右側(cè)股動(dòng)脈置入動(dòng)脈導(dǎo)管進(jìn)行有創(chuàng)血壓監(jiān)測，監(jiān)測孕兔實(shí)驗(yàn)過程中的心率、血壓、氧飽和度等生命體征。從左側(cè)股動(dòng)脈插入4F Fogarty 動(dòng)脈取栓導(dǎo)管，插入深度約10 cm，至降主動(dòng)脈與子宮動(dòng)脈分支處，即腎動(dòng)脈開口下端、子宮動(dòng)脈上端。HI組、SCH 0.04 mg/kg組、SCH 0.12 mg/kg組及DMSO組的動(dòng)物向?qū)Ч芮蚰覂?nèi)注入0.3 mL生理鹽水?dāng)U張球囊，完全阻斷子宮血供造成胎兔缺血，持續(xù)25 min，造成胎兔宮內(nèi)缺氧缺血；SO組不擴(kuò)張球囊，留置導(dǎo)管25 min。股動(dòng)脈阻斷時(shí)間結(jié)束即刻，實(shí)驗(yàn)組即通過耳緣靜脈注射提前幾分鐘配制好的2 mL藥物(SCH58261或溶劑DMSO)。SCH58261溶于10% DMSO，按劑量給藥， DMSO組給予10% DMSO 2 mL，HI組不給任何試劑，縫閉切口，局部消毒，返回兔籠。部分實(shí)驗(yàn)過程圖片見圖1。

Figure 1.Photos in the process of experiments. A:NS (0.3 mL) was injected into the 4F artery catheter which was in the left femoral artery. The blood pressure was completely detectable. B: slow withdrawal of the NS evacuated the sacculus and resulted in the blood pressure recovery to normal.

圖1 實(shí)驗(yàn)過程照片

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和一般情況記錄 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，均在術(shù)后24 h(孕30 d)行剖宮產(chǎn)，將存活新生兔置入已提前預(yù)熱為35 ℃的嬰兒暖箱內(nèi)保暖。記錄一般請(qǐng)況包括單窩產(chǎn)崽數(shù)、新生兔的死胎率、出生體重等。

2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 在新生兔生后5 min內(nèi)進(jìn)行，本研究重點(diǎn)評(píng)估翻正反射，記錄10次翻正反射中，能成功從仰臥位翻為俯臥位的次數(shù)及得分，并計(jì)算平均值。在神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分完成后經(jīng)腹腔注射5%水合氯醛后直接斷頭取腦。在雪花碎冰上鋪一個(gè)滅菌的彎盤，操作者帶無菌手套在彎盤內(nèi)分離腦組織，分別取雙側(cè)額皮質(zhì)、海馬、紋狀體，放入2 mL無菌凍存管內(nèi)，立即放液氮罐暫時(shí)保存，當(dāng)次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 質(zhì)譜法測孕兔血清、新生兔血清及腦組織的SCH58261濃度 將3只孕兔在缺氧缺血后即刻耳緣靜脈內(nèi)給予SCH58261 0.04 mg/kg，10 min后剖宮產(chǎn)。3只孕兔共產(chǎn)崽16只，其中死產(chǎn)新生兔4只，剩余12只新生兔取血液和腦組織標(biāo)本檢測SCH58261濃度。將新生兔通過腹腔內(nèi)注射5%水合氯醛鎮(zhèn)靜，按每100 g體重給予25 mg水合氯醛。暴露心臟，從心尖區(qū)插入黑色頭皮針，立即抽取心臟血液。待心臟采血完成后，新生兔即刻斷頭取腦組織，用生理鹽水洗去淤血，保存于液氮罐中。(1) 血液標(biāo)本：在4 ℃冰箱靜置4 h后，置于4 ℃低溫離心機(jī)中，12 000 r/min離心15 min，取上清淡黃色樣液于新的無菌去酶1.5 mL EP管，保存于-80 ℃超低溫冰箱中。(2) 腦組織標(biāo)本：將整個(gè)腦組織解凍，稱重，置于玻璃組織勻漿器中，按1∶5加入0.1 mol/L HCl并研磨勻漿，移至玻璃管中，加5 mL氯仿，渦旋60 s，室溫下400×g離心10 min，離心過程重復(fù)3次，最后取下清液轉(zhuǎn)移至無菌去酶1.5 mL的EP管中，于55～58 ℃，去塞，水浴氮?dú)獯蹈桑@得約2 mL左右含SCH58261溶液，保存于-20 ℃低溫冰箱中。用100 μL流動(dòng)相溶解殘余物，取20 μL注入質(zhì)譜儀，按本法條件測定胎兔血、腦的SCH58261濃度。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)檢測各腦區(qū)Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá) 取各腦區(qū)(皮質(zhì)、海馬和紋狀體)腦組織80～100 mg，用TRIzol試劑、氯仿和異丙醇提取總RNA。用可見光分光光度計(jì)測總 RNA的濃度和純度，A260/A280為1.8～2.2，濃度為1.5～2.0 g/L。逆轉(zhuǎn)錄體系含RNA 2 μg、引物1 μL、去離子水加至12 μL，再加入逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、RNasin 1 μL、dNTP混合液2 μL，將上述總共20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系充分混勻，行普通PCR先確認(rèn)標(biāo)本具有陽性表達(dá)后，再用real-time PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增。引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成，Bcl-2(153 bp)的上游引物為5’-GGACGCGAAGTGCTATTGGT-3’，下游引物為5’-TCACGATCTCCCGGTTATCATA-3’；Bax(149 bp)的上游引物為5’-CCCAGCATCCTTCCCACG-3’，下游引物為5’-CCCAAGGAAGACAAGAGCATCA-3’；GAPDH(172 bp)的上游引物為5’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’，下游引物為5’-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3’。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s; 95 ℃5 s、60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。運(yùn)用2-ΔΔCt方法，得出mRNA的相對(duì)表達(dá)量。最終結(jié)果由PCR儀配套軟件自動(dòng)計(jì)算。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)測定各組胎兔各腦區(qū)p-P38蛋白的水平 取凍存于-80 ℃的各腦區(qū)(皮質(zhì)或海馬或紋狀體)腦組織約100 mg，并加入400 μL裂解液(含5 μL PMSF)迅速在冰上研磨，將勻漿液冰浴 30 min，使其充分裂解。4 ℃高速低溫離心機(jī)，12 000 r/min離心30 min，取上清裝入1.5 mL的EP管；4 ℃高速低溫離心機(jī) 12 000 r/min離心5 min，取上清，用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，各蛋白樣本分別加入樣本緩沖液調(diào)濃度至2 g/L，100 ℃煮10 min進(jìn)行蛋白變性。制備10%丙稀酰胺分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行蛋白分離(每泳道20 μL)，預(yù)先將PVDF膜浸泡甲醇數(shù)秒，用于轉(zhuǎn)印蛋白，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別在不同孵育小盒中加入抗P38抗體(1∶1 000)、抗p-P38抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜(約16～18 h)； 分別加入相應(yīng)的Ⅱ抗室溫孵育1.5 h。TBST洗膜，最后于暗室曝光，將膠片掃描至電腦中，用 Quantity One 凝膠圖像分析軟件分析P38和p-P38的吸光度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用W檢驗(yàn)判斷資料是否為正態(tài)分布。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 孕兔及新生兔的一般情況

各組孕兔的體重、單窩產(chǎn)崽數(shù)和新生兔的出生體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；SCH 0.04 mg/kg組和SCH 0.12 mg/kg組孕兔的死胎率明顯低于HI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；SCH 0.04 mg/kg組和SCH 0.12 mg/kg組孕兔的死胎率較DMSO組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見表1。

2 新生兔行為學(xué)評(píng)估

新生兔的翻正反射能力可作為神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估結(jié)果。SCH 0.04 mg/kg組和SCH 0.12 mg/kg組絕大多數(shù)新生兔可維持俯臥位姿勢(shì)，有前向運(yùn)動(dòng)或圓周運(yùn)動(dòng)，較快速地從仰臥位翻正為俯臥位，翻正反射得分的均值在2分左右，吞咽協(xié)調(diào)功能和對(duì)酒精嗅覺刺激的反應(yīng)能力良好。HI組存活的新生兔出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)行為學(xué)異常表現(xiàn)，較多不能維持正常的俯臥位姿勢(shì)，肢體常常偏向一側(cè)；往往出現(xiàn)翻身困難，10次翻身反射中，成功從仰臥位翻正為俯臥位的次數(shù)明顯減少，翻正反射得分低于SCH 0.04 mg/kg組和SCH 0.12 mg/kg組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。但SCH 0.04 mg/kg組和SCH 0.12 mg/kg組的得分均比SO組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。DMSO組翻正反射得分與HI組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見表1。

表1 新生兔的一般情況

*P<0.05vsHI group;*P<0.05vsDMSO group.

3 孕兔血清、新生兔血清及腦組織的SCH58261濃度

新生兔血清和腦組織中均能檢測到SCH58261的存在，由于將新生兔腦組織按1∶5比例加入0.1 mol/L HCl制成約1 mL腦勻漿，再加5 mL氯仿萃取約2 mL含SCH58261溶液，此時(shí)，腦組織SCH58261濃度被稀釋約2倍，因此，新生兔腦組織SCH58261濃度應(yīng)為新生兔腦組織萃取液SCH58261濃度的2倍左右，平均濃度為40 μg/L左右。新生兔血清SCH58261的濃度為(81.5±23.1) μg/L，約為孕兔血清SCH58261濃度[(816.8±135.1) μg/L]的1/10，新生兔實(shí)際腦組織SCH58261的濃度為(21.2±6.2) μg/L，約為新生兔血清SCH58261濃度的1/2。其中一組新生兔腦組織SCH58261的濃度測定結(jié)果見圖2。

4 皮質(zhì)、海馬及紋狀體區(qū)Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)情況

Real-time PCR結(jié)果顯示，SCH 0.04 mg/kg組和SCH 0.12 mg/kg組皮質(zhì)、海馬和紋狀體Bcl-2的mRNA表達(dá)均高于HI組(P<0.05)，DMSO組雖然與HI組相比略有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；SCH 0.12 mg/kg組較SCH 0.04 mg/kg組Bcl-2的mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，見表2。

SCH 0.04 mg/kg組、SCH 0.12 mg/kg組皮質(zhì)、海馬、紋狀體Bax的mRNA表達(dá)低于HI組(P<0.05)，SCH 0.12 mg/kg組較SCH 0.04 mg/kg組Bax的mRNA表達(dá)減少(P<0.05)，見表2。

5 皮質(zhì)、海馬及紋狀體區(qū)p-P38的蛋白水平

SCH 0.04 mg/kg組和SCH 0.12 mg/kg組皮質(zhì)、海馬及紋狀體區(qū)p-P38 MAPK/P38 MAPK的比值均小于HI組(P<0.05)，DMSO組與HI組相比略有減小，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；SCH 0.12 mg/kg組皮質(zhì)區(qū)p-P38 MAPK/P38 MAPK的比值較DMSO組減小(P<0.05)，且與SCH 0.04 mg/kg組相比稍減少(P<0.05);與SO組皮質(zhì)區(qū)相比，SCH 0.12 mg/kg組p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值仍較大(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.Determination of SCH58261 concentration in the brain tissue of newborn rabbits. A: the figure showed that the concentration sensitivity of SCH58261 was 1 μg/L; B: the figure showed that SCH58261 concentration in the brain tissue of the newborn rabbits was measured.

圖2 新生兔腦組織萃取液測得的SCH58261濃度

表2 皮質(zhì)、海馬及紋狀體Bcl-2和 Bax的mRNA表達(dá)

*P<0.05vsHI group;#P<0.05vsSCH 0.04 mg/kg group.

Figure 3.The protein level of p-P38 MAPK in the cortex (A), hippocampus (B) and striatum (C) of the newborn rabbits determined by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsHI group;▲P<0.05vsSCH 0.04 mg/kg group.

圖3 皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及紋狀體區(qū)p-P38的蛋白水平

討 論

缺氧、缺血是新生兒腦損傷的常見原因，目前臨床上尚無特效治療方法，而其較高的致死率和致殘率又決定了尋求新的治療策略具有重要的臨床意義。新生動(dòng)物腦組織發(fā)育不成熟，對(duì)缺氧缺血刺激的病理改變與成年動(dòng)物不盡相同。Bcl-2和Bax在未成熟腦HIBD后神經(jīng)細(xì)胞凋亡中扮演重要角色[8]，而P38 MAPK磷酸化后可通過多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。此外，研究證實(shí)MAPK家族，特別是P38 MAPK，通過阻斷IL-1β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)而發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10]。

本研究通過左側(cè)股動(dòng)脈向4F Fogarty動(dòng)脈取栓導(dǎo)管球囊內(nèi)注入0.3 mL生理鹽水，經(jīng)右側(cè)股動(dòng)脈連接生命監(jiān)測儀，觀察到右側(cè)股動(dòng)脈血壓監(jiān)測不到，說明已完全阻斷子宮血供，成功造成宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型，當(dāng)抽空球囊后，右側(cè)股動(dòng)脈恢復(fù)血供，血壓恢復(fù)阻斷前水平，提示此過程中孕兔模擬出人的急性胎盤功能不全的臨床過程。

目前國內(nèi)外使用宮內(nèi)窒息模型的研究尚少，因此未發(fā)現(xiàn)關(guān)于SCH58261能否通過胎盤屏障的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過孕兔耳緣靜脈內(nèi)單次給予SCH58261，首先需證實(shí)SCH58261能通過胎盤屏障從而經(jīng)過胎兔血腦屏障而到達(dá)胎兔腦組織。目前尚未發(fā)現(xiàn)利用高效液相色譜法或質(zhì)譜分析技術(shù)直接測定腦組織中腺苷A2A受體拮抗劑SCH58261的報(bào)道，本研究查閱相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)Xie等[11]的研究，利用SCH58261是咖啡因的衍生物，與其有相似的分子結(jié)構(gòu)，參考其提取小鼠腦組織中咖啡因的具體方法，提取新生兔腦組織和血清SCH58261，通過質(zhì)譜分析技術(shù)測得標(biāo)本SCH58261在新生兔血液和腦組織的濃度，證實(shí)其能通過胎盤屏障和血腦屏障，從而保障了本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究結(jié)果的可靠性。

另外，成年小鼠的腦缺血研究中，通過腹腔單次給SCH58261 0.01 mg/kg，本研究的給藥劑量根據(jù)動(dòng)物的體表面積換算成基礎(chǔ)給藥劑量0.004 mg/kg，并且最終為此給藥劑量10倍和30倍即0.04 mg/kg和0.12 mg/kg，通過孕兔耳緣靜脈注射，此方法便捷，并且對(duì)胎兔的創(chuàng)傷性小。本研究HI后通過孕兔耳緣靜脈注射SCH58261 0.04 mg/kg，得到新生腦組織SCH58261濃度約為40 μg/L，推測SCH58261在新生兔腦組織中已達(dá)到起效濃度。

缺氧缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為在未成熟腦神經(jīng)細(xì)胞死亡中起主導(dǎo)作用，而Bcl-2和Bax在凋亡途徑中起著重要作用，Bcl-2通過阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用，凋亡的細(xì)胞又使Bcl-2 的mRNA表達(dá)量明顯下降。腦損傷發(fā)生后，腦細(xì)胞ERK水平急劇升高，NF-κB磷酸化，P38 MAPK過度磷酸化[12]。P38 MAPK磷酸化后可作為上游因子通過多種途徑如接受信號(hào)刺激引起線粒體膜的通透性增加，Bax從胞質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)移而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[13]。

本研究通過建立胎兔宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷模型后，利用real-time PCR和 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測胎兔腦組織勻漿發(fā)現(xiàn)，HI組與假手術(shù)組相比，HI組新生兔腦組織皮質(zhì)、海馬及紋狀體區(qū)的P38 MAPK磷酸化水平均明顯升高，Bcl-2 的mRNA表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，Bax的mRNA表達(dá)均呈上調(diào)狀態(tài)，提示Bcl-2和Bax在未成熟腦HIBD后皮質(zhì)、海馬及紋狀體區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起著重要作用。P38 MAPK信號(hào)通路在缺氧缺血的應(yīng)激下，可能作為上游因子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，提示其在腦缺血性損傷中發(fā)揮重要作用。

腺苷A2A受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要分布在紋狀體，在皮質(zhì)和海馬也有分布；星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)A2A受體[14]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。P38 MAPK磷酸化是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)鍵步驟，而腺苷A2A受體可能通過引起P38 MAPK磷酸化，而加重腦損傷[15]。Silva等[16]研究證實(shí)腺苷A2A受體直接影響一系列的有害刺激，促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡，認(rèn)為阻斷腺苷A2A受體能夠減少海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡。

由于處于發(fā)育期的腦組織與成熟腦組織具有十分明顯的差異，且胎兒在子宮內(nèi)處于一個(gè)相對(duì)缺氧的環(huán)境中，近年來關(guān)于腺苷A2A受體在很多HIBD模型中發(fā)揮作用的作用存在爭議。?dén等[17]將7日齡的新生小鼠腺苷A2A受體基因敲除后進(jìn)行單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎造成缺氧缺血性腦損傷，腺苷A2A受體基因敲除小鼠腦損傷和運(yùn)動(dòng)異常率比對(duì)照組反而增高，提示敲除腺苷A2A受體基因后加重腦損傷[17]，推斷若阻斷新生小鼠腺苷A2A受體可能會(huì)加重腦損傷，這與成年動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)的使用腺苷A2A受體拮抗劑能夠阻止腦損傷后的神經(jīng)元壞死的結(jié)果剛好相反[18]。

本研究證實(shí)了HIBD后給予SCH58261，各腦區(qū)如皮質(zhì)、海馬及紋狀體區(qū)Bcl-2的mRNA表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào)，Bax的mRNA表達(dá)均呈下調(diào)狀態(tài)，說明p-P38 MAPK的減少具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，且real-time PCR和 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與HI組相比，SCH 0.04 mg/kg組與SCH 0.12 mg/kg組各指標(biāo)有改善，提示宮內(nèi)HIBD后予SCH58261 0.04 mg/kg能減輕圍產(chǎn)期HIBD，增加劑量至0.12 mg/kg，其神經(jīng)保護(hù)作用較0.04 mg/kg更明顯，是否再增加劑量而保護(hù)作用呈上升趨勢(shì)有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)考究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Adenosine A2Areceptor antagonist SCH58261 attenuates hypoxic-ischemic brain damage in a fetal rabbit model

LIU Yan-li, TANG Zhen-hai, WANG Neng-li, LIN Zhen-lang

(DepartmentofNeonatology,YuyingChildren’sHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China.E-mail:linzhenlang@hotmail.com)

AIM: To study the effect of adenosine A2Areceptor antagonist SCH58261 on hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) in a mature fetal rabbit model.METHODS: Pregnant New Zealand white rabbits at gestational day 29 were selected and were randomly divided into sham-operated group, hypoxic-ischemic group, SCH58261 0.04 mg/kg group, SCH58261 0.12 mg/kg group and DMSO group. The intrauterine rabbit HIBD model was established. All pregnant rabbits were subjected to cesarean section 24 h after the sham operation or experimental procedure to induce hypoxic-ischemic injury in the fetus. The survival neonatal rabbits were kept in a neonatal incubator at 35 ℃. The general conditions of the newborn rabbits were recorded. The degree of neurobehavioral damage in the newborn rabbits was estimated by a neurobehavioral scoring protocol. The concentration of SCH58261 in the serum of pregnant rabbits, the serum of neonatal rabbits and the brain tissues of neonatal rabbits was measured by mass spectrometry. The mRNA expression of Bcl-2/Bax and protein levels of p-P38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) in the cortex, hippocampus and striatum area in the brain of the neonatal rabbits were determined by real-time PCR and Western blot. RESULTS: SCH58261 was detected in the serum and brain tissues of the newborn rabbits. The SCH58261 concentration was approximately 40 μg/L in the brain tissue of the newborn rabbits. The mRNA expression of Bcl-2 in the cortex, hippocampus and striatum of brain tissues in SCH58261 0.04 mg/kg group and SCH58261 0.12 mg/kg group was higher, and the mRNA expression of Bax was lower than those in HI group (P<0.05). The protein level of p-P38 MAPK in the cortex, hippocampus and striatum of brain tissues was reduced in SCH58261 0.04 mg/kg group and SCH58261 0.12 mg/kg group compared with HI group (P<0.05). The protein level of p-P38 MAPK in SCH58261 0.12 mg/kg group was a little lower than that in SCH58261 0.04 mg/kg group (P<0.05). CONCLUSION: Adenosine A2Areceptor antagonist SCH58261 attenuates hypoxia-ischemia induced neonatal brain injury by blocking adenosine A2Areceptor, subsequently inhibiting p-P38 MAPK phosphorylation to reduce neuronal apoptosis.

Adenosine A2Areceptor antagonist; Hypoxic-ischemic brain damage; Peripartum

1000- 4718(2016)12- 2139- 08

2016- 06- 18

2016- 09- 06

衛(wèi)生部新生兒疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題

R722; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.004

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△通訊作者 Tel: 0577-88002798; E-mail： linzhenlang@hotmail.com