A型肉毒桿菌神經毒素重鏈干預大鼠脊髓損傷后蛋白表達的初步研究*

蘭 婧， 王 紅， 白 娟， 王亞芳， 李夏青

(山西醫科大學病理生理教研室， 山西 太原 030001)

A型肉毒桿菌神經毒素重鏈干預大鼠脊髓損傷后蛋白表達的初步研究*

蘭 婧， 王 紅， 白 娟， 王亞芳， 李夏青△

(山西醫科大學病理生理教研室， 山西 太原 030001)

目的： 初步觀察大鼠脊髓損傷模型基礎上局部注射小劑量A型肉毒桿菌神經毒素重鏈(BoNT/A HC)后對局部蛋白表達譜的影響，為探討BoNT/A HC干預在體神經損傷后相關蛋白表達及其干預神經再生機制提供實驗基礎。方法：復制大鼠單側腰段脊髓損傷模型；采用SDS-PAGE及雙向電泳觀察不同劑量BoNT/A HC(2 μg、4 μg、6 μg和8 μg)對脊髓損傷后局部(包括損傷部位及其近頭端部分脊髓組織)蛋白表達譜的干預作用。結果：大鼠單側腰段脊髓損傷2 d時局部脊髓組織結構明顯破壞崩解，損傷波及左側脊髓灰質及白質；脊髓損傷局部SDS-PAGE及考馬斯亮藍染色顯示，于損傷同時局部一次性注射不同劑量BoNT/A HC后，某些蛋白表達與單純損傷組相比明顯不同，而與正常組基本一致；雙向電泳結果進一步顯示，損傷局部注射6 μg BoNT/A HC后2 d和20 d時，在不同等電點及不同蛋白分子量水平上，有10余種蛋白表達與單純損傷組明顯不同，呈向正常轉化的趨勢。結論：大鼠脊髓損傷局部注射BoNT/A HC一定時間可影響損傷局部蛋白表達譜的變化，這種變化呈現由損傷造成的蛋白表達變化被轉向正常的趨勢。

脊髓損傷； A型肉毒桿菌神經毒素重鏈； 神經損傷； 神經再生

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是由于創傷性或非創傷性因素導致的脊髓結構破壞，譬如創傷、炎癥、腫瘤及缺血等。嚴重的脊髓損傷可導致損傷相應節段所支配的軀體運動及感覺功能障礙。由于脊髓損傷局部的神經細胞及白質纖維缺乏再生能力，因此脊髓損傷是一種致殘率極高的疾病，嚴重影響人們的正常生活，同時給家庭和社會帶來沉重的負擔。長期以來，探討促進脊髓損傷后修復的各種手段成為神經科學領域的研究熱點。

A型肉毒桿菌神經毒素(botulinum neurotoxin type A， BoNT/A)是迄今研究最為廣泛且早已用于臨床實踐的肉毒桿菌毒素。BoNT/A的毒性機制主要是通過其分子結構中的重鏈與運動終板神經突起前膜上相應受體結合介導其分子結構中的輕鏈入胞、并通過輕鏈的Zn2+依賴性蛋白水解酶作用導致突觸小體相關蛋白25(synaptosomal-associated protein 25， SNAP-25)裂解，使突觸囊泡內神經遞質(乙酰膽堿)釋放受阻，骨骼肌收縮障礙發生麻痹[1-2]。除影響乙酰膽堿外，BoNT/A對不同神經細胞突觸囊泡內的其它遞質或多肽如P物質、鈣調素相關基因多肽等也具有抑制釋放作用[1]。根據其致病機理，臨床上BoNT/A主要用于面肌痙攣、斜頸、多汗癥、慢性神經性痛、美容除皺等[3]。一些在體動物實驗發現BoNT/A局部注射引起肌肉麻痹的后期局部出現運動終板樣結構形成[4]。除此外，體外實驗也觀察到培養液內加入BoNT/A可以直接刺激原代運動神經元突起生長[5-6]。基于上述研究，本實驗采用大鼠脊髓損傷半離斷模型局部注射人工重組的BoNT/A重鏈(heavy chain, HC)，以期觀察BoNT/A對脊髓損傷后局部蛋白表達譜的影響，為探討BoNT/A重鏈干預在體神經損傷后相關蛋白表達及其干預神經再生機制提供實驗基礎。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和分組

雄性SD大鼠，6～7周齡，體重200～220 g，由北京海淀興旺實驗動物養殖場提供，許可證號為SCXK(京)2014-0013。實驗分為4組(每組4只)：(1)單純損傷組(一側腰段脊髓離斷性損傷)；(2)脊髓損傷+BoNT/A HC干預 2 d組，BoNT/A HC劑量分別采用2 μg、4 μg、 6 μg和8 μg，于損傷當時由注射器注入脊髓腔內；(3)脊髓損傷+BoNT/A HC 干預20 d組，劑量及方法同 (2)；(4)正常對照組，只行皮膚切開、暴露背部脊椎，不進行脊髓損傷。

2 方法

2.1 單側腰段脊髓損傷模型復制 脊髓損傷模型的方法及步驟參照文獻進行并略作改動[7]。大致損傷步驟如下：用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.3～0.4 mL/kg)麻醉大鼠后將其背位固定于手術臺上。腰段脊髓定位：大鼠俯臥位時根據髂后上棘首先定位腰3～腰4(L3～L4)椎間隙，以此向頭端依次確定6節脊椎，第6和第7節為胸9～胸10(T9～T10)椎間隙，以T9～T10緊靠后棘突間左側插入改良的直形注射器針頭直至椎板，垂直提拉針頭十數次并做背腹部抽動，抽出直形針頭后再用彎形針頭在同一位置進行背腹部提拉數十次。損傷過程中大鼠出現脊椎向腹側彎曲、損傷側后肢短暫抽搐，表明損傷成功，縫合筋膜及皮膚，模型復制完畢。待動物麻醉蘇醒后呈現一側后肢拖地行走，表明造模成功。

2.2 HE染色確定損傷部位及范圍 于大鼠腰段脊髓損傷模型復制后1 d，經4%多聚甲醛溶液(新鮮配置，4 ℃)灌注固定后，由背部打開脊髓腔，暴露損傷部位脊髓，分別于損傷處上一脊髓及下一脊髓段切取脊髓組織置于4%多聚甲醛進行后固定(1 h)，標本置于30%蔗糖溶液4 ℃冰箱內過夜，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、行脊髓額狀縱形切片(切片厚度5 μm)，經蘇木素-伊紅(HE)染色后，對損傷的范圍及程度進行觀察。

2.3 BoNT/A 重鏈髓腔內注射 脊髓損傷模型同時由改良的損傷器針頭連接微量注射器注入人工重組的BoNT/A重鏈(List Biological Laboratories)溶液，總量為20 μL。每只大鼠給藥量分別為 2 μg、4 μg、6 μg及8 μg，將所需劑量的BoNT/A重鏈溶于20 μL生理鹽水內進行注射。

2.4 脊髓蛋白表達的檢測

2.4.1 單向凝膠電泳及考馬斯亮藍染色 于模型復制+不同劑量BoNT/A重鏈干預后2 d、20 d時在深度麻醉狀態下，沿原手術切口打開背部皮膚，用咬骨鉗經腰椎第3～4椎間隙依次而上打開椎板至脊髓損傷部位，充分暴露脊髓，用剃須刀片在距損傷上下2～3 mm處分別切斷，取出脊髓，將損傷側脊髓分離作為測定標本。將標本用剪刀剪碎，置入玻璃管研磨器中，加入預冷的蛋白裂解液內(蛋白裂解液配置方法：尿素 21 g、硫脲 7.9 g、DTE 0.5 g和Tris 0.5 g，純水定容至50 mL)。每3 mm脊髓組織加500 μL裂解液，每個脊髓標本共加入裂解液1 000 μL，標本置于玻璃研磨器內于冰上研磨成為組織懸液。并將組織懸液進行超聲間斷粉碎3 min，進一步充分裂解蛋白。組織蛋白懸液內加入5倍體積的預冷丙酮震蕩混合，-20 ℃沉淀2 h或過夜；次日將組織混懸液進行離心(4 ℃，12 000×g30 min)，棄去上清，收集沉淀；加入蛋白裂解液(500 μL)再次懸浮沉淀，充分混勻后采用ABC法進行蛋白含量測定。

將20 μg樣本蛋白溶于凝膠電泳樣本溶解液內，水浴中煮沸10 min。分別上樣于15%的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳(電壓 80～100 mV，時間 1.5 h)。凝膠置于0.025% 考馬斯亮藍溶液中(考馬斯亮藍 0.025 g、甲醇 400 mL，冰乙酸 70 mL，純水定容至1 000 mL)漂染2 h，用洗脫液(甲醇 400 mL和冰乙酸 70 mL，純水定容至1 000 mL)對凝膠進行漂洗3～4 h，染色后的凝膠條帶經Bio-Rad圖像處理系統進行成像分析。

2.4.2 雙向電泳及銀染色 蛋白提取方法同4.1，蛋白上樣量為150 mg。選用pH 3～10 NL IPG預制干膠條，進行第一向等電聚焦； 將聚焦完成的膠條用 2D equilibration buffer [6 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)， 30%甘油， 2%SDS， 1% DTT，痕量溴酚藍] 進行清洗和平衡；將平衡后的膠條放入凝膠板中，加入低熔點瓊脂糖封膠液(0.5%低熔點瓊脂糖+電泳緩沖液)，室溫靜置20 min后進行第二向電泳。第二向聚丙烯酰胺凝膠濃度為12.5%，電泳參數設定為100 mV，45 min，隨后改為200 mV直至溴酚藍離膠下沿0.5 cm處停止；冷循環設定溫度為15 ℃。

對完成電泳后的凝膠進行硝酸銀染色。大致染色步驟為凝膠水化、10%乙醇漂洗及敏化、0.1%硝酸銀染色20 min、充分水洗后加入銀染色顯影液(0.25%碳酸鈉、0.04%甲醛溶液)顯影3～5 min、充分水洗；采用Bio-Rad凝膠成像系統對銀染色后的凝膠進行成像及分析處理。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 5.0統計軟件進行統計學處理。實驗數據用均數±標準誤(mean±SEM)表示，多組間均數差異用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠腰段脊髓半離斷損傷及HE染色

模型復制2 d后，由L3～L4椎間隙依次向上打開椎板充分暴露腰段脊髓。肉眼可見損傷部位位于腰膨大下部，局部充血腫脹，與周圍組織較易辨別。低倍鏡可見損傷部位主要位于脊髓左側(損傷側)。損傷側脊髓正常結構破壞、組織斷斷續續，脊髓前后角及灰白質不可辨認，損傷側外側面脊髓組織缺失。高倍鏡下可見損傷處神經組織呈現液化性壞死、損傷灶內部分神經細胞呈現典型壞死形態學特征(核濃縮、碎裂)、小血管明顯擴張、損傷區域炎性細胞浸潤不十分明顯。除此外，鏡下可見損傷灶越過中央管略向對側延伸，脊髓中央管不易辨認,見圖1。

Figure 1.Gross and histological views of unilateral lumbar spinal cord injury. A: one-side damage was observed on the dorsum of the lumbar spinal cord; B: the longitudinal section of spinal cord including the injury site; C: the cross section of spinal cord injury location; D: the gray matter which surrounded the injury site with clear normal histological features (magnification); E: the center of the damage location with obvious destruction in structures and micro-foci of liquefaction, the gray and white matter couldn’t be recognized.

圖1 單側腰椎脊髓損傷的大體觀和組織學形態

2 脊髓損傷局部注射BoNT/A重鏈對局部蛋白表達譜的影響

損傷后2 d脊髓局部的蛋白表達與正常對照組相比，損傷局部的蛋白表達譜發生明顯變化，其中主要表現在分子量為180 kD、120 kD、40 kD及30 kD附近的蛋白表達量明顯增加，而分子量約在65 kD的蛋白質降解成數條蛋白帶，分子量約在75 kD的蛋白表達減少。BoNT/A重鏈注射后2 d及20 d，上述相應部位的蛋白表達不同程度地趨向于正常對照組的表達譜特征；更值得注意的是，在6 μg BoNT/A HC注射后20 d左右，分子量約在75 kD、65 kD及20 kD部位的蛋白表達量甚至超過正常對照組。凝膠電泳的考馬斯亮藍染色的初步結果提示BoNT/A HC可能干預脊髓損傷后損傷局部蛋白的表達,見圖2。

Figure 2.The comparison of protein expression in spinal cord tissue after unilateral spinal cord injury with different doses of BoNT/A heavy chain injection. *: the protein bands displayed various changes after injury of spinal cord, most of which increased and some degraded; #: the obvious reversal effect of BoNT/A heavy chain on the proteins with decreased expression after spinal cord injury; !: BoNT/A heavy chain reduced the protein expression which appeared increased after injury.

圖2 單側脊髓損傷并注射不同劑量的BoNT/A HC后損傷脊髓組織中蛋白表達的比較

3 BoNT/A 重鏈干預脊髓損傷局部蛋白表達

雙向電泳結果顯示脊髓損傷后局部蛋白整體表達譜發生明顯變化，一些蛋白表達明顯增多，而另一些蛋白的表達則減少或消失。這些蛋白表達的變化有些呈集中趨勢，表現為蛋白組群整體變化，而大部分則為一些散在的蛋白表達點的變化?？傮w上看，可以將這些蛋白表達發生變化的區域按照等電點(isoelectronic point，pI)及分子量(molecular weight，MW)的交叉分成4個亞區： a區： pI在8～9， MW為60～110 kD； b區： pI在5～6， MW為25 kD左右； c區： pI在6～7， MW為20 kD左右； d區： pI接近8， MW為45 kD左右,見圖3。

將上述部位進一步放大可以看到，單純損傷后a區的蛋白表達呈點群表達量增多,主要集中于MW接近60 kD水平上有多組蛋白表達水平較正常對照組顯著增多(P<0.01)；除此外，MW在110 kD水平位置的蛋白表達也明顯增強。BoNT/A 重鏈注射后2 d，上述2個部位的蛋白表達即表現明顯下降，注射后20 d時，上述部位蛋白表達特征與正常對照組極相似，差異無統計學顯著性，見圖4。 單純損傷時c區的突出變化是在分子量為18.4 kD及20 kD的水平上分別出現2個新的蛋白表達點。BoNT/A 重鏈用藥2 d時18 kD水平的蛋白表達明顯降低，而對20 kD位置的蛋白表達未顯示干預作用；用藥20 d時，上述2個位點的蛋白表達與正常對照組基本接近，差異無統計學顯著性，見圖5。

Figure 3.Analysis of the protein expression in the spinal cord tissue after unilateral spinal cord injury with different doses of BoNT/A heavy chain injection by 2-demensional SDS-PAGE. a, b, c and d pointed the location where the protein expression altered after injury and intervention with BoNT/A heavy chain. MW: molecular weight; pI: isoelectronic point.

圖3 單側脊髓損傷并注射BoNT/A HC不同時間后脊髓組織蛋白表達的雙向電泳分析

單純脊髓損傷時b區和d區2個部位分別有數個蛋白點呈現表達降低，第1個蛋白點出現在b區，分子量約為50 kD左右，損傷后表達基本消失；第2個及第3個出現在d區，分子量基本接近，在25 kD左右，二者損傷時皆表達減少。采用BoNT/A 重鏈后2 d，b區的蛋白表達有所回升，用藥達20 d時，蛋白表達水平基本達到正常對照組水平，而d區的2個蛋白點在BoNT/A 重鏈用藥2 d時，表達呈現回升，用藥達20 d時又表現減少，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖6。

總之，在體脊髓損傷時脊髓局部組織蛋白質表達變化非常顯著，一些蛋白質組群表達增強，甚至出現新的蛋白質，而另外一些蛋白表達則明顯降低。BoNT/A重鏈的給予可以使這些由于損傷發生變化的蛋白質出現向正常轉化的趨勢，使損傷后表達增強的蛋白質趨于降低，表達減少的蛋白質趨于增多，且隨著給藥后時間的延長這種逆轉作用表現更為突出。

Figure 4.Comparison of the protein expression at the selective location from Figure 3a (MW range: 45～116.2 kD). →: the protein located at 100 kD level;: the protein located at 60 kD. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsinjury group.

圖4 圖3中a區域蛋白表達的比較

Figure 5.The comparison of the protein expression at the selective location from Figure 3c (MW range: 14～20 kD). →: the protein located at 20 kD level;: the protein located at 18 kD. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsinjury group.

圖5 圖3中c區域蛋白表達的比較

Figure 6.The comparison of the protein expression at the selective location from Figure 3d (A; MW range: 45～60 kD) and Figure 3b (B; MW range: 20～30 kD). →: MW was around 50 kD;: MW was around 23 kD;: MW was around 25 kD. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsinjury group.

圖6 圖3中d和b區域蛋白表達的比較

討 論

脊髓損傷后的修復是臨床醫學的難題之一，探索能夠促進脊髓損傷后修復或尋找能刺激局部存活神經細胞恢復再生能力的新藥/制劑是神經科學領域重要研究方向。迄今，很多研究者對此進行了多種嘗試，譬如：在椎管內注入神經營養因子；將神經干細胞植入損傷局部；按照中醫的方法進行針灸、按摩、電針或中藥離子導入，促進患者脊髓功能的康復[8-10]。然而，由于上述各種治療的局限或不確定性，目前仍未找到治療脊髓損傷后再生的有效藥物及療法。

BoNT/A與神經再生之間的關系起源于對肉毒毒素局部注射后期出現新的運動終板樣結構的形成及體外實驗BoNT/A可刺激原代運動神經元神經突起生長[4]。BoNT/A的化學結構為蛋白多肽，分為重鏈和輕鏈，兩者借二硫鍵相互連接。毒素重鏈主要與宿主細胞膜上的特異受體結合介導毒素入胞；進入胞漿的輕鏈是毒素發揮毒性的催化單位[11]。采用商品化的人工重組的BoNT/A重鏈僅保留毒素的入胞結構域而排除了毒素的毒性結構。因此，這種人工重組的BoNT/A重鏈體內應用不會引起肉毒毒素中毒反應，而且毒素重鏈與宿主細胞膜上相應受體的結合及隨后的受體-配體內吞入胞勢必會引起細胞內某些信號系統的激活。我們前期的體外實驗已經證實人工重組的BoNT/A重鏈可促進Neuro-2a細胞突起增長并可促進某些再生相關信號分子，譬如ERK1/2及Akt的磷酸化[5-6]。

脊髓損傷后采用BoNT/A重鏈干預是否可促進局部的損傷修復目前尚無報道。在本實驗中當損傷同時給予BoNT/A重鏈后一定時間，可使損傷后某些增加或減少的蛋白質表達量趨于正?；?，SDS-PAGE+考馬斯亮藍及2-D膠電泳的結果提示BoNT/A 重鏈對脊髓損傷后蛋白產生干預作用的位點分布相對較廣，較為明顯的變化出現在分子量為60～110 kD、45 kD及18～25 kD的蛋白點或組群。在單純損傷時，這些部位的蛋白表達有些增高，有些降低，甚至損傷后出現個別新的蛋白表達點，當采用不同劑量BoNT/A重鏈注射后，這些損傷后的蛋白表達譜呈現逆轉性變化、與正常對照組的脊髓蛋白表達譜接近，尤以用藥后20 d時表現明顯；多數觀察到的蛋白變化在損傷后給藥2 d與給藥20 d呈現逐步恢復到正常的趨勢，與單純損傷時相比差異有統計學意義，總體上體現了BoNT/A重鏈逆轉損傷所帶來的脊髓蛋白表達異常的作用。

發育成熟的中樞神經細胞基本喪失其再生能力，即使神經元仍然存活，其上行突起也不能再生，不能與上一級神經細胞的軸突形成突觸；另外中樞神經系統損傷時伴有的髓鞘崩解破壞而產生的髓磷脂抑制因子，通過與神經細胞膜上相應受體結合而發揮其對軸突生長的抑制作用，與此同時，髓鞘崩解產物刺激膠質細胞增生形成的膠質瘢痕也對神經細胞的再生修復產生阻礙。因此，不論是腦還是脊髓損傷后，這些髓磷脂相關抑制因子及其膠質瘢痕蛋白的表達增加。據文獻報道，可溶性髓磷脂相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)和少突細胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp)分子量皆在110 kD左右，這些蛋白皆屬于髓磷脂抑制因子[12]。本實驗中發現單純脊髓損傷時MW在110 kD、pI為8左右的蛋白點或蛋白組群數量表達明顯增多，當采用BoNT/A重鏈后2 d時這些分子量水平的蛋白組群數量及蛋白表達均有所下降，到20 d時呈現與正常對照組類似的水平。另外，雙向電泳結果顯示MW在60 kD左右、pI為8～9的堿性蛋白質在損傷后也明顯增多，當采用BoNT/A重鏈后2 d這些分子量水平的蛋白組群數量及蛋白表達均也有所下降，到20 d時也呈現與正常對照組類似的水平。研究結果已經證實，Nogo-66(來源于髓磷脂的另一種生長抑制蛋白)以及髓磷脂抑制因子受體的分子量分別為66 kD和65 kD[13]。中樞神經系統損傷后局部所產生的大量髓磷脂抑制因子與神經軸突膜上相應受體結合、激活細胞內抑制信號通路(譬如RhoA-ROCK-MLC)最終導致成熟中樞神經系統神經元軸突再生抑制。從上述2個位點的蛋白表達譜變化可以推測，BoNT/A 重鏈局部注射可能一方面通過干預髓磷脂抑制因子的產生或降解而削弱其抑制作用；另一方面可能通過減少神經軸突膜上神經抑制因子相應受體的表達而減少髓磷脂抑制因子的作用。因此，BoNT/A 重鏈促神經再生的現象有可能通過降低髓磷脂抑制因子的抑制作用而實現。

除此之外，實驗中還觀察到單純脊髓損傷時MW在45 kD、pI為堿性的一些蛋白表達點較正常對照組明顯減少，而在BoNT/A重鏈注射后2 d就顯示其表達灰度值有所恢復，甚至較正常對照組略偏高。 就目前所知，體內一些再生相關蛋白或再生相關信號蛋白，譬如ERK1/2、Akt、GAP-43、Wnt/β-catenin、Eph-Ephrin、JNK等蛋白分子量多在40～55 kD之間[5-6, 14-15]。ERK1/2、Akt是目前公認的參與組織細胞再生的重要信號蛋白；生長相關蛋白43是一種胞膜磷酸蛋白質,與神經再生關系密切。損傷后再生能力越強，再生的軸突末梢生長相關蛋白-43的表達也就越明顯[16]。有文獻報道增加Wnt/β-catenin、Eph-Ephrin及JNK的表達或促進激活可以促進中樞神經系統的再生。因此本實驗結果提示，BoNT/A重鏈可能在抑制髓磷脂抑制因子及其受體的同時，促進神經突起或細胞內一些參與再生的信號蛋白分子的表達。事實上，我們前期的體外實驗結果已經證實BoNT/A重鏈可促進ERK1/2和Akt/PKB的磷酸化[5]。

在本實驗中還觀察到，MW約在25 kD、pI為5～6的一些小分子蛋白在單純損傷時表達減少，而在BoNT/A重鏈用藥2 d時表達明顯增多，但用藥達20 d時則變化不明顯。小鳥嘌呤核苷三磷酸酶的Rho家族成員——RhoA、Rac1、Cdc42等皆屬于小分子蛋白[17]。如前所述，RhoA是細胞內生長抑制信號通路中的重要啟動蛋白，RhoA的表達減少或抑制則標志著下游信號通路不能被激活，神經生長抑制作用被削弱。然而，由于只是在BoNT/A重鏈注射后2 d時小分子水平的蛋白表達較單純損傷組減少，而用藥時間達到20 d時這種現象消失，因此考慮這種變化可能屬于BoNT/A重鏈對某些蛋白表達的短效作用。

總之，上述多個位點的蛋白表達變化特征提示，脊髓損傷后給予BoNT/A重鏈可以干預局部蛋白的表達、促進損傷后局部蛋白代謝趨向正常化； BoNT/A重鏈可能通過多種機制促進神經損傷后修復再生，譬如削弱神經生長抑制因子的抑制作用，增強再生相關蛋白的表達等。

由于本實驗所得結果僅僅是脊髓損局部的整體蛋白表達譜的變化，就目前的結果也還不能解釋BoNT/A重鏈干預脊髓損傷后蛋白的具體機制。然而蛋白表達譜的變化對于闡明BoNT/A重鏈在脊髓損傷后再生修復中的作用至關重要，因此，有待于今后在此基礎上進行蛋白質譜并結合蛋白生物信息學技術對BoNT/A重鏈所引起的脊髓損傷后蛋白表達的逆轉進行更進一步的分析，以期最終能夠闡明BoNT/A重鏈干預神經損傷后再生的確切機制。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Botulinum neurotoxin type A heavy chain intervenes in expression of ge-neral proteins in spinal cord after unilateral spinal cord injury in rats

LAN Jing, WANG Hong, BAI Juan, WANG Ya-fang, LI Xia-qing

(DepartmentofPathophysiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:xqli2013@126.com)

AIM: To observe the effect of botulinum neurotoxin type A heavy chain (BoNT/A HC) on the pattern of spinal protein expression by intrathecal injection after spinal cord injury in rats, and to explore the role of BoNT/A HC intervention in spinal protein expression and some of its mechanisms in nerve regeneration after injury. METHODS: The model of unilateral lumbar spinal cord injury was established. The effects of BoNT/A HC intervention at different doses (2 μg, 4 μg, 6 μg and 8 μg) on the general pattern of protein expression in the spinal cord tissues at the injury site and the cranial part adjacent to the injury site was measured and evaluated by SDS-PAGE and Coomassie brilliant blue staining first, and then by two-dimensional SDS-PAGE. RESULTS: The histological structure of the ipsilateral side of lumbar spinal cord showed obvious destruction and degradation, mainly affecting both gray and white matter of the left side of the cord. The result of SDS-PAGE with Coomassie brilliant blue staining from injured spinal cord tissue displayed that the expression of some proteins after one-time BoNT/A HC treatment appeared obviously different from that without BoNT/A HC treatment. Moreover, the pattern of the protein expression affected by BoNT/A HC was similar to that of the normal spinal cord. The more detail information from two-dimensional SDS-PAGE indicated that more than 10 proteins with different molecular weight and isoelectronic points were differentially expressed at day 2 and day 20 after local injection of 6 μg BoNT/A HC. This altered expression actually appeared a tendency toward the pattern shown in normal group. CONCLUSION: The immediate application of BoNT/A HC at the injury site after unilateral lumbar spinal cord injury is able to affect the pattern of local protein expression. The altered protein expression by injury could be reversed back to normal or approximately normal by local BoNT/A HC administration.

Spinal cord injury; Botulinum neurotoxin type A heavy chain; Nerve injury; Nerve regeneration

1000- 4718(2016)12- 2125- 08

2016- 07- 08

2016- 09- 09

國家自然科學基金資助項目(No. 81171178)；山西省回國留學人員科研資助項目(No. 2012046)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.002

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0351-4135067； E-mail: xqli2013@126.com