表面活性劑產生菌的篩選與優化及其產物性質的分析

摘要：從被石油污染的土壤中用藍色凝膠培養基分離篩選出1株產糖脂類生物表面活性劑的菌株B2。經生理生化試驗與16S rDNA序列分析將該菌株鑒定為沙雷氏菌屬（Serratia sp.）。經紅外光譜與薄層層析分析，結果表明該菌株產生的表面活性劑是一種鼠李糖脂。以發酵液的表面張力為指標，通過正交試驗確定最佳發酵條件，即以20 g/L豆油為碳源、5 g/L尿素為氮源、溫度34 ℃、pH 7.0、發酵時間96 h。在此最佳條件下測得表面活性劑的產量為3.746 1 g/L。該菌株所產表面活性劑水溶液在其濃度為臨界膠束濃度時的表面張力為180 mN/m。

關鍵詞：生物表面活性劑；表面張力；產率；最佳發酵條件

中圖分類號：Q935 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-3980-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.045

Abstract： A biosurfactant-producing bacteria， strain B2，was isolated by blue agar plate from the contaminated soil in Jilin oilfield. Through the analyses of physiological， and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence， the strain B2 preliminarily identified as Serratia sp. The analysis recults of infrared spectral and thin-layer chromatography analysis indicated that the biosurfactant produced by strain was a kind of rhamnolipid. The surface tension of fermentation solution as the index， the optimum fermentation conditions were obtained by orthogonal test. The optimum fermentation conditions were 20 g/L soybean oil as carbon source，5 g/L urea as nitrogen source，temperature of 34 ℃， pH of 7.0 and fermentation time of 96 h. Under the optimal fermentation conditions， the yield of biosurfactant produced by the strain could reach 3.746 1 g/L. The critical micelle concentration of biosurfactant solution was 180 mN/m.

Key words： biosurfactant； surface tension； yield； optimal fermentation conditions

生物表面活性劑由微生物發酵產生，是一種生物大分子物質且具有表面活性[1]。微生物發酵得到的生物表面活性劑結構復雜，種類較多，包括磷脂、脂肽、糖脂、脂蛋白等[2]。此類物質在農業、食品工業、化妝品、醫藥、生物環境修復、石油工業和水處理等領域被廣泛應用[2，3]。尤其在微生物采油和石油烴污水處理領域應用較多。在石油的開發、使用以及運輸過程中，難免造成石油泄漏，石油浸入土壤污染生活用水，這無疑是對自然環境與人類生存的巨大挑戰。自然界中存在大量可以降解石油烴的微生物，但是由于石油烴的疏水性阻礙了其在水中的分散程度，使微生物無法與石油烴有效接觸，導致無法對其進行快速而充分地降解。油的乳化可提高油滴的分散程度，使微生物與油滴更容易接觸，從而促進微生物對石油烴的降解[4]。一般情況下，化學合成的表面活性劑不容易自然降解，容易形成新的污染，但是，生物表面活性劑不但乳化效果明顯而且易于自然降解。

生物表面活性劑雖然具有諸多優點，但是其較高的生產成本和較低的產率是其致命的弱點。所以降低生產成本、選育可高效產表面活性劑的菌株以及發酵培養條件的優化是目前研究的重點[5]。本試驗篩選出一株高效表面活性劑產生菌并對其發酵條件進行優化，以期為表面活性劑的廣泛應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采自吉林油田（松原市）中多處被石油污染的土壤。

1.1.2 培養基 富集培養基：（NH4）2SO4 10.0 g、KCl 1.1 g、NaCl 1.1 g、MgSO4 0.5 g、KH2PO4 3.4 g、K2HPO4 4.4 g、酵母膏0.5 g、菜油20 g、微量元素溶液5.0 mL，pH 7.0，去離子水1 L，高壓蒸汽滅菌[5]。

微量元素溶液：ZnSO4 0.29 g、CaCl2 0.24 g、CuSO4 0.25 g、MgSO4 0.17 g、去離子水1 L[6]。

藍色凝膠培養基：牛肉膏1.0 g、蛋白陳5.0 g、酵母膏0.2 g、葡萄糖20.0 g、十六烷基三甲基溴化胺0.2 g、亞甲基藍0.005 g、瓊脂18.0 g、去離子水1 L，高壓蒸汽滅菌[7]。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂18.0 g，pH 7.0～7.5，去離子水1 L。

發酵培養基：與富集培養基相同。

1.2 試驗方法

1.2.1 富集培養 在6個土樣中分別取5 g土樣溶于95 mL去離子水中，在200 r/min、室溫條件下，搖床振蕩2 h，然后靜置1 h。無菌條件下取上清液10 mL接種到90 mL的富集培養基中，并于200 r/min、30 ℃條件下培養3 d。再取此菌液5 mL接入新的富集培養基中，重復3次，繼代培養，獲得以表面活性劑產生菌為優勢種的菌液。

1.2.2 菌株篩選與純化 藍色凝膠平板篩選法：在藍色凝膠平板上將富集液進行稀釋涂布，于30 ℃培養箱中培養2～3 d，觀察并挑選出菌落周圍藍圈較大且生長比較旺盛的菌株[7]。挑取產生藍圈且生長旺盛的單菌落，在牛肉膏蛋白胨培養基上采用平板劃線法，于30 ℃培養箱中培養2～3 d得到單菌落。再重復劃線培養2次，最終可以得到純化的菌株。將得到的菌株用牛肉膏蛋白胨斜面培養基在30 ℃條件下培養3 d后，于4 ℃冰箱中保藏。

1.2.3 菌株鑒定 將最終得到的菌株通過形態學分析與生理生化試驗鑒定，再經牛肉膏蛋白胨培養基連續多次平板繼代后，由上海生工生物工程技術服務有限公司進行16S rDNA序列分析。

1.2.4 生物表面活性劑的提取 將培養3～4 d后的發酵液于4 ℃條件下6 000 r/min離心40 min，除去菌體保留上清液；上清液用濃鹽酸調至pH 2.0，4 ℃靜置過夜后可出現絮狀沉淀；4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，保留沉淀，用pH 2.0的鹽酸全部洗下，再用1 mol/L的NaOH溶液將pH調至7.0，冷凍干燥后，即可得到疏松狀黃褐色的粗產品；將粗產品用CH2Cl2進行萃取，減壓蒸餾后溶于0.01 mol/L的NaOH溶液，過濾；將上清液用濃鹽酸調pH至2.0，再次出現沉淀時，于10 000 r/min、4 ℃條件下離心30 min，保留沉淀且再次冷凍干燥，即可得到純化的生物表面活性劑[8]。

1.2.5 生物表面活性劑的分析鑒定 將提取的生物表面活性劑進行傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析、薄層層析（TLC）分析。將提取的表面活性劑用去離子水分別配制成濃度為20、40、60、500 mg/L。在常溫下分別測定其水溶液的表面張力，得出其臨界膠束濃度。

1.2.6 單因素試驗

1）不同碳源對發酵液表面張力的影響。將發酵培養基中的碳源分別換成淀粉、葡萄糖、豆油、石蠟油和正丁醇，每種碳源濃度分別設置為5、10、15、20、25、30 g/L，配制30種發酵培養基，接種后在200 r/min、30 ℃條件下搖床培養3 d，分別測定每種發酵液的表面張力。

2）不同氮源對發酵液表面張力的影響。將碳源試驗中獲得的最佳碳源作為選定碳源，然后將發酵培養基中的氮源分別換成NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、（NH4）2SO4和尿素，每種氮源濃度分別設置為5、10、15、20、25、30 g/L，配制30種富集培養基，接種后在200 r/min、30 ℃條件下搖床培養3 d，分別測定每種發酵液的表面張力。

3）初始pH對發酵液表面張力的影響。選確定的最佳碳氮源進行試驗，分別以pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0作為初始pH，接種后在200 r/min、30 ℃條件下搖床培養3 d，分別測定每種發酵液的表面張力。

4）發酵時間對發酵液表面張力的影響。發酵時間分別設為48、72、96、120、144 h。接種后在200 r/min、30 ℃、pH 7.0條件下搖床培養3 d，分別測定每種發酵液的表面張力。

5）發酵溫度對發酵液表面張力的影響。發酵溫度分別設為25、28、31、34、37 ℃。接種后在200 r/min、pH 7.0條件下搖床培養96 h后，分別測定每種發酵液的表面張力。

1.2.7 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，選取影響較大的4個因素（豆油濃度、尿素濃度、培養溫度和初始pH），每個因素取3個水平進行正交試驗。試驗因素和水平見表1。

2 結果與分析

2.1 生物表面活性劑產生菌的分離篩選

通過富集培養和篩選，在6個土樣中得到6株初篩菌株。這6株菌株在相同條件下經發酵培養基培養3 d后，測定其發酵液的表面張力。經過復篩，得到1株生長最旺盛、發酵液表面張力為29.7 mN/m的菌株，命名為B2。

2.2 生物表面活性劑產生菌的鑒定

試驗表明，菌株B2呈淡黃色，大小適中，直徑1.0～2.0 mm，邊緣整齊，半透明，表面濕潤。經顯微鏡觀察，菌體短桿狀，無芽孢。經革蘭氏染色試驗鑒定為陰性。菌株B2的生理生化特征見表2。根據生理生化結果初步鑒定，菌株B2為沙雷氏菌屬（Serratia sp.）。

利用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，得到長約1.4 kb的目的片段，擴增結果見圖1。通過測序，菌株B2的16S rDNA序列共1 441 bp，將該測序結果與GenBank中現有的菌種16S rDNA基因序列進行比對，發現菌株B2與多株沙雷氏菌的16S rDNA核酸序列的同源性高達99%以上，依據此結果，再結合生理生化試驗與形態學觀察，最終確定菌株B2屬于沙雷氏菌屬（Serratia sp.）。

2.3 生物表面活性劑的傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析

生物表面活性劑的FT-IR分析結果見圖2。圖2中的多處吸收峰表明該分子中存在大量-CH2、

-OH、C=C不飽和雙鍵、C=O和C-O-C鍵，分子中還存在環狀內酯結構和糖苷鍵；C=O的存在，表明該生物表面活性劑為不飽和脂肪和芳香類化合物，且該分子中有不飽和糖脂類物質，其中糖基端為親水基端，環酯類的碳鏈為疏水基端。可初步斷定該生物表面活性劑為不飽和糖脂類物質。

2.4 生物表面活性劑的薄層層析（TLC）分析

將生物表面活性劑產物的濃溶液點樣于硅膠平板上，展開30 min后干燥，用苯酚-硫酸顯色，發現1個棕色斑點，且Rf值為0.68。而鼠李糖標樣的Rf值也是0.68。采用菌株B2的發酵液進行薄層層析，在Rf值為0.68處也發現棕色斑點。這說明菌株B2產物的主要成分是鼠李糖脂類化合物。

2.5 臨界膠束濃度（CMC）的測定

由圖3可知，當表面活性劑水溶液的濃度低于180 mg/L時，溶液表面張力隨著濃度的升高而降低；當濃度大于等于180 mg/L時，溶液表面張力基本維持在30 mN/m左右。即該產物最低可將水的表面張力降至30 mN/m，且其臨界膠束濃度約為180 mg/L。常用的化學合成表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS）的CMC值為2 120 mg/L，十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）的CMC值為1 300 mg/L，該生物表面活性劑的CMC值遠遠低于化學合成表面活性劑。

2.6 發酵條件優化

2.6.1 不同碳源對發酵液表面張力的影響 由圖4可知，5種不同碳源對發酵液表面張力的影響不同，隨著碳源濃度的升高，發酵液表面張力呈不同的變化規律，其中在培養基中添加豆油，發酵液表面張力處于最低水平，因此，選擇20 g/L的豆油為最佳碳源。

2.6.2 不同氮源對發酵液表面張力的影響 由圖5可知，在不同氮源的選擇中，發酵培養基中添加不同濃度尿素時，發酵液表面張力處于較低水平，因此，選擇5 g/L的尿素為最佳氮源。

2.6.3 初始pH對發酵液表面張力的影響 由圖6可知，當初始pH為7.0時，發酵液表面張力最小，因此，選擇最佳pH為7.0。

2.6.4 發酵時間對發酵液表面張力的影響 由圖7可知，隨著發酵時間的延長，發酵液表面張力先降低后升高，當發酵時間為96 h，發酵液表面張力最小，因此，選擇最佳發酵時間為96 h。

2.6.5 發酵溫度對發酵液表面張力的影響 由圖8可知，隨著發酵溫度的升高，發酵液表面張力先降低后升高，當發酵溫度為34 ℃，發酵液表面張力最小，因此，選擇最佳發酵溫度為34 ℃。

2.6.6 正交試驗結果 正交試驗結果如表3所示。由極差分析可知，RA>RC>RB>RD，各因素對發酵液表面張力的影響主次順序為A、C、B、D。即碳源對表面張力的影響最大，其次是培養溫度和氮源，而初始pH對表面張力的影響最小。根據表3可知，菌株B2的最佳發酵水平為A3B1C3D2，在此條件下進行驗證試驗發現發酵液的表面張力降到27.6 mN/m，比優化前發酵培養基同等條件下發酵液的表面張力要小，所以本試驗菌株B2的最優發酵條件確定為尿素5 g/L，KCl 1.1 g/L，NaCl 1.1 g/L，KH2PO4 3.4 g/L，K2HPO4 4.4 g/L，MgSO4 0.5 g/L，豆油20 g/L，酵母膏0.5 g/L，微量元素溶液5.0 mL/L，pH 7.0，最佳溫度34 ℃，培養時間96 h。

3 小結與討論

在自然界中，有很多能夠產糖脂類生物表面活性劑的微生物，如Arthrobacter sp.、Rhodococcus、Corynebacterium、Torulopsis和Pseudomonas等[9]。本試驗從松原市吉林油田被石油污染的土壤中篩選出1株可以高效產糖脂類生物表面活性劑的菌株B2。經形態學觀察、生理生化試驗與16S rDNA序列分析將該菌株鑒定為沙雷氏菌屬（Serratia sp.）。經優化后確定出最佳發酵條件為尿素5 g/L，NaCl 1.1 g/L，KCl 1.1 g/L，K2HPO4 4.4 g/L，KH2PO4 3.4 g/L，MgSO4 0.5 g/L，酵母膏0.5 g/L，豆油20 g/L，微量元素溶液5.0 mL/L，pH 7.0，溫度34 ℃， 培養96 h。在此最佳條件下測得發酵液的表面張力為27.6 mN/m。沈薇等[10]篩選出的菌株LY4，糖脂產量較高，達到6.8 g/L。劉曉蘭等[11]報道的產生糖脂的一株菌種，其最高糖脂產量達到7.073 g/L。而試驗中，該菌株B2經優化后的表面活性劑產量為3.746 1 g/L。與同期相比存在著一定差距，需要進一步誘變以及確定更佳的培養條件。

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