百草枯對人肝HepG2細胞存活力和凋亡的影響

摘要：探討百草枯（PQ）對人肝細胞的毒性。采用甲基噻唑藍試驗和流式細胞術分別檢測了PQ處理24 h對人肝HepG2細胞存活力和凋亡的影響。PQ處理24 h時，對HepG2細胞存活力的半數抑制濃度為51.17 mg/L；7.21 mg/L的PQ處理24 h即可啟動HepG2細胞的早期凋亡程序，隨著PQ處理濃度的增大，HepG2細胞的總凋亡率先升高后降低，而細胞壞死率持續升高。PQ對人肝HepG2細胞具有明顯毒性，會抑制HepG2細胞的存活力，低濃度時主要誘導細胞凋亡，高濃度則主要導致細胞壞死，說明保肝類藥物可能對PQ中毒有較好療效。

關鍵詞：百草枯；HepG2細胞；甲基噻唑藍試驗；流式細胞術；存活力；凋亡

中圖分類號：R994.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）12-3088-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.12.023

Abstract： The cytotoxicity of paraquat （PQ） on human liver was explored comprehensively. Changes of viability and apoptosis were determined respectively by methyltetrazolium assay and flow cytometry in human hepatic HepG2 cells after 24 h PQ treatment. 24 h median inhibitory concentration of viability was 51.17 mg/L in HepG2 cells treated by PQ. Early apoptotic HepG2 cells were observed in 7.21 mg/L PQ treatment group. The total apoptotic rate of HepG2 cells went up at first and went down at last， but the necrotic rate kept a continuous increasing tendency with the increase of PQ treatment concentrations. PQ had a heavy toxicity on human hepatic HepG2 cells， inhibited cell viability， induced mainly cell apoptosis at a low concentration and cell necrosis at a high concentration， and which suggested liver protection drugs were possible to be effective for the treatment after PQ poisoning.

Key words： paraquat； HepG2 cell； methyltetrazolium assay； flow cytometry； viability； apoptosis

百草枯（Paraquat，PQ）是一種水溶型快速滅生性除草劑，因其易于被土壤吸附、在環境中殘留量相對較低和具有良好的除草效果，PQ先后在全球120多個國家60多種作物中被廣泛使用[1]。但自1962年注冊生產以來，這個使用量在全球僅次于草甘膦的除草劑已經引起了嚴重的公共健康問題，由PQ導致的生產和使用接觸而死亡的事件時有報道[2-4]。

通過對PQ中毒病人、死者和試驗處理動物進行研究，人們發現體內蓄積的PQ在肺內沉積最多，PQ中毒之后往往首先導致呼吸衰竭[5-7]。此外，腎作為水溶物質的排泄器官，其在PQ中毒之后發生的變化受到人們的廣泛關注[8，9]。近年來的慢性毒性試驗發現，PQ引起的部分病理特征與一些衰老疾病癥狀相似，隨之PQ的神經毒性被深入探討[10，11]。但PQ對其他器官的毒性報道較少，至今仍沒有針對PQ中毒的良好治療策略和高效解毒劑[12]，因此人們對PQ的毒性及機制的認識仍不完全。

眾所周知，肝是機體最重要的解毒器官，肝細胞在外源毒物的降解過程中往往發揮著舉足輕重的作用，因此，解讀肝細胞在PQ處理后發生的變化對全面理解PQ的毒性效應及機制具有重要意義，有助于尋找新的方法提高肝對PQ的抵抗力、發揮肝對PQ中毒的解除功效，但PQ中毒對人肝細胞的影響并未受到足夠的關注。人肝癌細胞HepG2具有肝細胞的多種代謝和轉化酶系，是良好的肝細胞研究模型[13]。因此，本研究以人肝HepG2細胞作為試驗材料，采用MTT和雙色流式細胞術分別檢測了PQ對HepG2細胞存活力和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用人肝HepG2細胞株由鄭州大學第五附屬醫院贈送。

PQ購自美國Chem Service公司（1910-42-5），去離子水溶解備用；胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）購自杭州四季青公司（2104）；DMEM（Dulbecco′s modified eagle medium）培養基購自美國Hyclone公司（30022.01B），試驗中常規培養細胞用的培養液為90% DMEM+10% FBS的混合液；0.25%胰酶購自美國Life Technologies公司（15050-057）；甲基噻唑藍（Methyltetrazolium，MTT）購自上海碧云天生物技術研究所（C0009）；二甲基亞砜購自美國Amresco公司（D8370）；異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）標記膜偶聯蛋白V（Annexin-V）和碘化丙啶（Propidium iodide，PI）雙色流式試劑盒購自北京嘉美紐諾生物科技有限公司（LHK601-020），內含Annexin-V FITC染液、PI染液、10×結合緩沖液，其中結合緩沖液用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS）稀釋至1×。其他常規試劑均由河南師范大學生命科學學院實驗辦公室提供，分析純以上等級。

使用的主要儀器包括香港Heal Force公司生產的HF90型細胞培養箱、蘇州華宇凈化設備公司生產的SW-CJ-2F（D）型超凈工作臺、德國Leica公司生產的DMIL LED fluo型數碼倒置顯微鏡、美國Thermo Fisher Scientific公司生產的Multiskan酶標儀、美國BD公司生產的FACS VerseTM型流式細胞儀（隨機配備有FACS上樣管和BD FACSuite分析軟件）。

1.2 細胞的培養和傳代

一般情況下，人肝HepG2細胞以100 mm×20 mm單孔培養板培養，細胞培養箱內溫度為37 ℃，二氧化碳含量為5%，箱底層存300 mL去離子水保持濕度。細胞傳代主要操作如下：①細胞培養箱內取出培養板，PBS洗3次；②胰酶消化5 min，加PBS終止消化，輕輕吹吸貼壁細胞使之充分懸浮；③細胞懸液移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞；④新鮮培養液懸浮細胞，吸取細胞懸液轉移入新的培養板；⑤輕輕晃動培養板數次使HepG2細胞均勻鋪布板底面，作好標記后置于CO2培養箱內繼續培養。

1.3 百草枯對HepG2細胞存活力的影響

采用MTT法檢測PQ對HepG2細胞存活力的影響[14]，以確定PQ對細胞的毒性劑量范圍。具體操作如下：①胰酶消化、收集指數生長期的HepG2細胞，接種于96孔培養板，使待測細胞密度約5×104 個/孔；②培養細胞6 h后，加入0（正常組）、2、4、8、16、32、64、96 mg/L的PQ，繼續培養24 h，每個試驗組設6個復孔；③各孔加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，培養4 h；④吸棄各孔內的液體，加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩約5 min，使生成的紫色結晶物充分溶解；⑤迅速拿到酶標儀上，測量490 nm的吸光度，各PQ處理組吸光度與正常組吸光度之比即為PQ處理組細胞存活比率，以x±s表示，1-細胞存活比率=細胞存活力抑制率；⑥以PQ濃度為橫坐標、細胞存活力抑制率為縱坐標，Excel 2007作圖，擬合PQ處理濃度與細胞存活力抑制率的關系方程，由方程求出PQ對HepG2細胞存活力的半數抑制濃度（Median inhibitory concentration，IC50），依據IC50結果設定了細胞凋亡試驗的PQ處理濃度（0、7.21、10.67、15.78、23.36、34.57 mg/L）。

1.4 采用流式細胞術檢測百草枯對HepG2細胞凋亡的影響

采用Annexin-V FITC和PI雙色流式細胞術[15]。具體操作如下：①將HepG2細胞分成0（雙陰性對照組）、25.59 mg/L（FITC單陽性對照組）、51.17 mg/L（PI單陽性對照組），0（正常組）、7.21、10.67、15.78、23.36、34.57 mg/L的PQ處理組（每組3個重復），處理24 h；②胰酶消化、收集細胞；③PBS洗1次，棄上清，加入300 μL的1×結合緩沖液，懸浮細胞；④加入5 μL的Annexin-V FITC（雙陰性和PI單陽性對照組以PBS代替）混勻后，避光，室溫孵育15 min；⑤于流式細胞儀檢測前5 min加5 μL PI（雙陰性和FITC單陽性對照組以PBS代替）；⑥上機檢測前補加400 μL的1×結合緩沖液，之后將細胞懸液轉移至FACS管上機檢測，每板檢測20 000個細胞；⑦以BD FACSuite軟件對細胞進行亞群分區作圖，并計數各亞群細胞數。以Excel 2007對各試驗組不同亞群細胞比率（3個重復測定的x±s）作圖。

2 結果與分析

2.1 百草枯對HepG2細胞存活力的影響

以0、2、4、8、16、32、64、96 mg/L的PQ處理HepG2細胞24 h后，細胞的存活力通過MTT試驗進行了檢測，細胞存活力隨PQ處理濃度變化的結果記錄于表1。由表1可看出，隨著PQ處理濃度的增大，HepG2細胞的存活力越來越弱。由表1可知，不同濃度PQ對HepG2細胞存活力的抑制率，二者關系見圖1，由圖1獲得的擬合曲線方程計算出PQ對HepG2細胞的24 h-IC50為51.17 mg/L。

2.2 百草枯對HepG2細胞凋亡的影響

以BD FACSuite軟件對各試驗組細胞進行分析，其中9個試驗組的每組20 000個HepG2細胞的前向角和側向角檢測結果見圖2。在圖2中選擇密集且穩定的細胞群定義為P1群，進一步檢測P1群內細胞的FITC和PI著色情況，結果見圖3。

圖3-a、圖3-b和圖3-c分別顯示了FITC和PI雙陰性對照組、FITC單陽性對照組和PI單陽性對照組的P1細胞群結合FITC和PI的情況。根據該3個試驗組細胞分布的規律可劃出十字門，十字門的左下（Lower left，LL）區域表示FITC和PI均為陰性，右下（Lower right，LR）區域表示FITC陽性但PI陰性，右上（Up right，UR）區域表示FITC和PI均為陽性，左上（Up left，UL）區域表示FITC陰性但PI陽性。

LL區域為未發生凋亡的健康細胞，其胞膜完整，FITC和PI均不能結合于細胞上；LR區域為發生早期凋亡的細胞，該階段細胞胞膜內側的磷脂酰絲氨酸會外翻，因此可結合Annexin-V FITC；UR區域為晚期凋亡細胞，Annexin-V FITC可結合于磷脂酰絲氨酸，PI可進入細胞核錨定于核酸分子上，因此該類細胞可同時顯出FITC和PI雙色；UL區域為嚴重壞死細胞，PI分子可以進入細胞內結合核酸分子，但磷脂酰絲氨酸結構則可能已破壞，細胞無法結合Annexin-V FITC，因此僅顯示PI著色。

圖3-d、圖3-e、圖3-f、圖3-g、圖3-h和圖3-i分別表示正常組和7.21、10.67、15.78、23.36、34.57 mg/L的PQ處理組的P1細胞群結合FITC和PI的情況。以BD FACSuite軟件統計該6個試驗組P1細胞群中LL、LR、UR和UL區域細胞的比率，即為該6組細胞中健康、早期凋亡、晚期凋亡和壞死的比率，如圖4所示。

由圖4可知，隨PQ處理濃度增加，各PQ處理組健康HepG2細胞比率呈持續下降趨勢，壞死HepG2細胞比率呈持續上升趨勢，與正常組相比，34.57 mg/L的PQ處理組的健康細胞比率下降了35.01%，而壞死胞上升至34.52%；同時，隨PQ處理濃度增加，凋亡早期和晚期的細胞比率均明顯表現為先上升后下降趨勢；此外，對凋亡細胞比率和死亡細胞比率數據進行比較可見，在7.21、10.67、15.78 mg/L的PQ處理組，凋亡早期細胞比率即超過死亡細胞比率，而在23.36、34.57 mg/L的PQ處理組，凋亡早期和晚期細胞的總比率仍低于死亡細胞比率。綜合以上分析表明，低濃度的PQ處理主要導致HepG2細胞發生凋亡，而高濃度的PQ處理則主要導致HepG2細胞壞死。

3 小結與討論

近年來，關于PQ對人細胞的毒性試驗受到密切關注，Izumi等[16]報道PQ對肝癌PC12細胞的48 h-IC50約為25.81 mg/L；Narasimhan等[17]檢測PQ對多巴胺能神經元細胞的24 h-IC50約為128.5 mg/L。本研究通過MTT法測知PQ對HepG2細胞的24 h-IC50約為51.17 mg/L。依據Izumi等[16]的試驗結果，按照處理時間越長IC50越低進行推測，PQ對PC12的24 h-IC50應該與本研究比較接近。這表明同為肝細胞株的HepG2與PC12對PQ的耐受力接近。比較Narasimhan等[17]、Izumi等[16]和本研究的PQ分別對神經細胞和肝細胞的劑量-效應關系可見，PQ的肝毒性強于神經毒性。

參考檢測的PQ對HepG2細胞的24 h-IC50，本研究按1.48等比下降設計了一組處理濃度（7.21、10.67、15.78、23.36、34.57 mg/L）進行凋亡試驗，該組處理濃度保證了至少60%以上的HepG2細胞的存活力是正常的，這樣開展試驗不致于因PQ毒性過強直接導致細胞大批死亡而觀察不到毒性作用的細節。設計最高PQ濃度為34.57 mg/L時，其細胞活力不足65%，是為了確保處理濃度的PQ對HepG2細胞仍保持著較明顯的毒性，不致于因PQ毒性不足檢測不到相關指標變化。

PQ對細胞凋亡的影響近幾年受到廣泛關注，其中多數觀點認為PQ促進細胞凋亡，如Chang等[18]對胚胎神經干細胞的研究發現，PQ可促進凋亡因子P53和P51的表達，從而引發胚胎神經干細胞凋亡；Garcia等[19]在多巴胺神經元細胞的試驗中證實，PQ的處理抑制了細胞溶酶體水解酶和組織蛋白酶，使得自噬蛋白5依賴的細胞自噬增強，從而導致細胞凋亡增加；此外，Hong等[20]在其研究中認為，環木菠蘿烯醇阿魏酸酯可通過抑制Nrf2信號通路關鍵分子Nrf2、HO1和NQO1表達的途徑挽救PQ誘導的腎小球近端小管HK-2細胞的凋亡；Omura等[21]發現牛磺脫氧膽酸鈉可作為分子伴侶改變未折疊蛋白的表達水平，從而緩解PQ引起的內質網應激壓力導致的細胞凋亡。但Wang等[22]指出PQ不會導致中性粒細胞凋亡，PQ中毒后產生的活性氧可活化中性粒細胞的核因子-κB、促細胞分裂原激酶p38和骨髓細胞增殖因子-1，從而延長中性粒細胞的生命周期，同時，中性粒細胞不斷產生促炎因子如白介素-6和腫瘤壞死因子-α導致組織細胞產生更多的活性氧，該惡性循環不斷發展最終造成機體組織病變、器官衰竭。

本研究首次采用Annexin-V FITC和PI雙色流式細胞術同步檢測細胞膜磷脂酰絲氨酸的易位和膜的通透性2個凋亡指標的改變發現，低濃度的PQ （7.21 mg/L）即可明顯促進HepG2細胞發生早期凋亡，中等濃度（10.67 mg/L和15.78 mg/L）的PQ可大量促進HepG2細胞發生早期或晚期凋亡，高濃度（23.36 mg/L和34.57 mg/L）的PQ可促進HepG2細胞大量死亡，該結果與Chang等[18]、Garcia等[19]、Hong等[20]和Omura等[21]的結論一致，即證實PQ會誘導人細胞發生凋亡，不同之處是首次證明了PQ對肝細胞的促凋亡作用。此外，本試驗存活力和凋亡檢測的結果均表明，高濃度PQ對HepG2細胞的24 h致死性較強，這在一定程度上解釋了PQ毒性研究多年始終沒有發現有效療法或解毒劑的原因，即PQ中毒后，在解毒過程中起決定性作用的肝細胞本身發生了故障，機體內在的解毒能力可能已嚴重喪失或解毒生理反應難以發生，這提示保肝類藥物可能對PQ中毒會具有較好的療效。

綜上所述，PQ對人肝HepG2細胞的存活力有抑制作用，其中，51.17 mg/L的PQ處理可導致HepG2細胞的存活力被半數抑制。PQ可誘導人肝HepG2細胞發生凋亡，7.21 mg/L的PQ處理即可啟動細胞的早期凋亡程序，在低濃度的PQ處理組，HepG2細胞凋亡率隨PQ處理濃度增大而升高，但高濃度的PQ處理組HepG2細胞的凋亡率降低、壞死率升高。因此，PQ中毒之后，人肝的解毒能力將會下降，選擇保肝類藥物治療可能有利于提高肝對PQ的抵抗力、增強肝對PQ的解毒功效，從而緩解機體的中毒癥狀。

參考文獻：

[1] SZIGETI Z，RACZ I，L？魣SZTITY D. Paraquat resistance of weeds-the case of Conyza canadensis（L.） Cronq[J]. Z Naturforsch C，2001，56（5-6）：319-328.

[2] ZHOU Q，KAN B T，JIAN X D，et al. Paraquat poisoning by skin absorption： Two case reports and a literature review[J].Exp Ther Med，2013，6（6）：1504-1506.

[3] JONES B C，HUANG X M，MAILMAN R B，et al. The perplexing paradox of paraquat： The case for host-based susceptibility and postulated neurodegenerative effects[J]. J Biochem Mol Toxicol，2014，28（5）：191-197.

[4] SPANGENBERG T，GRAHN H，SCHALK H VAN DER，et al. Paraquat poisoning： Case report and overview[J].Med Klin Intensivmed Notfmed，2012，107（4）：270-274.

[5] TOYGAR M，AYDIN I，AGILLI M，et al. The relation between oxidative stress， inflammation， and neopterin in the paraquat-induced lung toxicity[J]. Hum Exp Toxicol，2015，34（2）：198-204.

[6] HARA H，YONEYAMA H，TANABE J，et al. Observations of the fibrosing process in paraquat lung injury by chest X-ray and CT[J]. Nihon Kyobu Shikkan Gakkai Zasshi，1991，29（5）：638-643.

[7] XIE H，WANG R，TANG X，et al. Paraquat-induced pulmonary fibrosis starts at an early stage of inflammation in rats[J]. Immunotherapy，2012，4（12）：1809-1815.

[8] WUNNAPUK K，LIU X，PEAKE P，et al. Renal biomarkers predict nephrotoxicity after paraquat[J].Toxicol Lett，2013，222（3）：280-288.

[9] MALLESHAPPA P. Acute kidney injury following paraquat poisoning in India[J].Iran J Kidney Dis，2013，7（1）： 64-66.

[10] MANGANO E N，LITTELJOHN D，SO R，et al. Interferon-γ plays a role in paraquat-induced neurodegeneration involving oxidative and proinflammatory pathways[J]. Neurobiol Aging，2012，33（7）：1411-1426.

[11] RAPPOLD P M，CUI M，CHESSER A S，et al. Paraquat neurotoxicity is mediated by the dopamine transporter and organic cation transporter-3[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（51）：20766-20771.

[12] GIL H W，HONG J R，JANG S H，et al. Diagnostic and therapeutic approach for acute paraquat intoxication[J]. J Korean Med Sci，2014，29（11）：1441-1449.

[13] PINTI M，TROIANO L，NASI M，et al. Hepatoma HepG2 cells as a model for in vitro studies on mitochondrial toxicity of antiviral drugs： which correlation with the patient[J]. J Biol Regul Homeost Agents，2003，17（2）： 166-171.

[14] BILMIN K，KOPCZYSKA B，GRIEB P. Influence of serum and albumin on the in vitro anandamide cytotoxicity toward C6 glioma cells assessed by the MTT cell viability assay： Implications for the methodology of the MTT tests[J].Folia Neuropathol，2013，51（1）：44-50.

[15] RIEGER A M，NELSON K L，KONOWALCHUK J D，et al. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death[J]. J Vis Exp，2011，50（e2597）：1-4.

[16] IZUMI Y，EZUMI M，TAKADA-TAKATORI Y，et al. Endogenous dopamine is involved in the herbicide paraquat-induced dopaminergic cell death[J].Toxicol Sci，2014，139（2）：466-478.

[17] NARASIMHAN M，RIAR A K，RATHINAM M L，et al. Hydrogen peroxide responsive miR153 targets Nrf2/ARE cytoprotection in paraquat induced dopaminergic neurotoxicity[J].Toxicol Lett，2014，228（3）：179-191.

[18] CHANG X，LU W，DOU T，et al. Paraquat inhibits cell viability via enhanced oxidative stress and apoptosis in human neural progenitor cells[J]. Chem Biol Interact，2013，206（2）：248-255.

[19] GARCIA A，ANANDHAN A，BURNS M，et al. Impairment of Atg5-dependent autophagic flux promotes paraquat- and MPP+ -induced apoptosis but not rotenone or 6-hydroxydopa-mine toxicity[J].Toxicol Sci，2013，136（1）：166-182.

[20] HONG G L，LIU J M，ZHAO G J，et al. The reversal of paraquat-induced mitochondria-mediated apoptosis by cycloartenyl ferulate， the important role of Nrf2 pathway[J].Exp Cell Res，2013，319（18）：2845-2855.

[21] OMURA T，ASARI M，YAMAMOTO J，et al. Sodium tauroursodeoxycholate prevents paraquat-induced cell death by suppressing endoplasmic reticulum stress responses in human lung epithelial A549 cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2013，432（4）：689-694.

[22] WANG X，LUO F，ZHAO H. Paraquat-induced reactive oxygen species inhibit neutrophil apoptosis via a p38 MAPK/NF-κB-IL-6/TNF-α positive-feedback circuit[J]. PLoS One，2014， 9（4）：e93837.