一株棲鹽田菌Salinicola sp. W1的柴油降解特性研究

摘要：結(jié)合Plackett-Burman設(shè)計與響應(yīng)面法，以柴油降解率為響應(yīng)值，對一株棲鹽田菌（Salinicola sp.） W1的柴油降解條件進(jìn)行了優(yōu)化。Plackett-Burman試驗結(jié)果顯示，F(xiàn)eSO4濃度、NH4NO3濃度和轉(zhuǎn)速是影響柴油降解的顯著因素。利用響應(yīng)面法對3個因素進(jìn)行了優(yōu)化，確定Salinicola sp. W1降解柴油的最佳條件是FeSO4濃度為0.1 mg/L，NH4NO3濃度為0.7 g/L，轉(zhuǎn)速為118 r/min。在最佳條件下，柴油的最大降解率可達(dá)95.2%。該菌株有望應(yīng)用于高鹽環(huán)境中柴油污染的微生物修復(fù)。

關(guān)鍵詞：柴油降解；棲鹽田菌（Salinicola sp.）；Plackett-Burman設(shè)計；響應(yīng)面法；生物表面活性劑

中圖分類號：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）12-3074-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.12.020

Abstract： The characterization of diesel degradation by Salinicola sp. W1 was investigated through Plackett-Burman design and response surface method，using diesel degradation rate as the response value. The results of Plackett-Burman design showed that FeSO4 concentration， NH4NO3 concentration，and rotational speed had significant influence on diesel degradation.Then these factors were optimized by response surface method，and the optimal FeSO4 concentration， NH4NO3 concentration，and rotational speed was 0.1 mg/L，0.7 g/L and 118 r/min， respectively. Under the optimal conditions，the diesel degradation rate could reach 95.2%. The Salinicola strain could have the potential application in the microbial remediation of diesel pollution in high salinity environment.

Key words： diesel degradation； Salinicola. sp； Plackett-Burman design； response surface method； biosurfactant

隨著柴油的廣泛應(yīng)用，生產(chǎn)、運輸、使用、存儲等環(huán)節(jié)因泄漏所造成的環(huán)境污染日益突出[1]。烷烴和芳香烴為主要的柴油組分，其在環(huán)境中長期滯留，對生物和環(huán)境均存在較大毒害作用[2]。因此，柴油污染的修復(fù)與治理具有重要意義。生物降解是徹底消除石油烴類污染物的重要途徑之一，但烴類的憎水結(jié)構(gòu)是限制其生物降解效率的主要因素[3]。微生物合成的生物表面活性劑可以提高石油烴的水溶性，從而促進(jìn)微生物對其的吸收和降解[4]。與化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑具有低毒、高效的乳化活性和生物可降解性等特點，因此在石油烴污染的治理中被廣泛應(yīng)用[5]。

Plackett-Burman（PB）設(shè)計法利用統(tǒng)計分析，可通過一次試驗從多個獨立的可調(diào)變量中篩選出對試驗結(jié)果有顯著影響的因素， 提高后期優(yōu)化試驗的有效性[6]。響應(yīng)面法（Response Surface Method，RSM）是一種基于統(tǒng)計學(xué)的過程優(yōu)化方法，其通過近似構(gòu)造一個多項式函數(shù)來表征目標(biāo)值受多個因素影響的情況，并最終實現(xiàn)目標(biāo)值的優(yōu)化。在有限的試驗次數(shù)下，該方法不僅能反映因素間的相互作用，而且可以避免正交試驗中只能對孤立試驗點分析的缺陷[7]。基于上述優(yōu)勢，Plackett-Burman（PB）設(shè)計法與響應(yīng)面法等統(tǒng)計學(xué)方法常聯(lián)合使用，在食品工業(yè)、生物化工及環(huán)境工程等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[8-10]。

前期研究從某海洋溢油沉積物中分離出一株表面活性劑產(chǎn)生菌Salinicola sp. W1，本研究結(jié)合Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面法對該菌株的柴油降解特性進(jìn)行了考察，以期在治理高鹽環(huán)境中的柴油污染方面有廣泛應(yīng)用，為柴油污染的微生物修復(fù)提供菌株和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 柴油 市售0#柴油，置通風(fēng)櫥內(nèi)放置，盡量除去易揮發(fā)烴類，棕色瓶中避光保存。

1.1.2 菌株 采用的表面活性劑產(chǎn)生菌為實驗室前期從某海洋溢油沉積物中分離到的菌株，經(jīng)16S rRNA鑒定為棲鹽田菌（Salinicola sp.）。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，磷酸高鐵0.01 g，人工海水1 000 mL，pH 7.4，

121 ℃滅菌15 min。

人工海水：NaCl 24 g，MgSO4·7H2O 7 g，NH4NO3 1 g，KCl 0.7 g，KH2PO4 2 g，Na2HPO4·12H2O 3 g，去離子水1 000 mL，pH 7.4，121 ℃滅菌15 min。

柴油培養(yǎng)基：柴油100.0 mg，NH4NO3 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，KCl 0.5 g，CuSO4 0.16 mg，F(xiàn)eSO4 0.12 mg，人工海水1 000 mL，pH 7.4，121 ℃滅菌15 min。

1.1.4 數(shù)據(jù)分析 利用Statease公司的軟件Design Expert 8.05b進(jìn)行Plackett-Burman試驗和響應(yīng)面試驗的設(shè)計及數(shù)據(jù)分析。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 活化培養(yǎng)：從平板上挑取一定量的菌株W1，接種至20 mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min條件下活化2 d，作為后續(xù)試驗菌種。

發(fā)酵培養(yǎng)：將活化后的菌種以5%（V/V）的接種量接種到50 mL柴油培養(yǎng)基中，并于30 ℃培養(yǎng)，進(jìn)行柴油降解特性考查。

1.2.2 菌株降解性能的條件優(yōu)化

1）顯著影響因子的篩選：選取柴油培養(yǎng)基中6個組分的濃度（柴油、NH4NO3、KCl、KH2PO4、CuSO4、FeSO4）和2個培養(yǎng)條件（pH、轉(zhuǎn)速）作為優(yōu)化因子，以柴油降解率為響應(yīng)值，利用Design Expert軟件中的Plackett-Burman設(shè)計試驗，篩選影響柴油降解的顯著性因子。

2）顯著影響因子的優(yōu)化：利用Design-Expert軟件中心組合設(shè)計法（Central Composite Design，CCD）設(shè)計試驗，對Plackett-Burman試驗獲得的3個顯著影響因子（NH4NO3濃度、FeSO4濃度、轉(zhuǎn)速）進(jìn)行優(yōu)化。以柴油降解率為響應(yīng)值，根據(jù)試驗進(jìn)行數(shù)學(xué)建模分析，并利用方差分析確定模型的可行性。

1.2.3 柴油降解率測定方法 培養(yǎng)液離心后，上清經(jīng)正己烷萃取3次，采用紫外分光光度法測定萃取液中的柴油含量。以正己烷為參比，用紫外分光光度計在200～400 nm波長下掃描，得到柴油的最大吸收波長。于最大吸收波長下測定培養(yǎng)液吸光度。柴油降解率的計算公式如下：

柴油降解率=×100% （1）

式中，A0和Ai分別為培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中柴油的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯著影響因子的篩選

利用Plackett-Burman設(shè)計篩選影響菌株W1降解柴油的顯著性因子。以柴油降解培養(yǎng)基中6個組分的濃度（柴油、NH4NO3、KCl、KH2PO4、CuSO4、FeSO4）和2個培養(yǎng)條件（pH、轉(zhuǎn)速）作為優(yōu)化因子（自變量），以柴油降解率為響應(yīng)值，試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

通過軟件Design Expert對測定結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到柴油降解率對所有自變量的二次多項式回歸方程：

R=75.14+6.56X1-10.00X2+3.97X3+4.19X4+6.96X5-12.74X6+3.39X7-9.42X8 （2）

式中，R為柴油降解率的預(yù)測值，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8分別為柴油濃度、NH4NO3濃度、KCl濃度、KH2PO4濃度、CuSO4濃度、FeSO4濃度、pH、轉(zhuǎn)速。

柴油降解率影響因素的主效應(yīng)分析結(jié)果見表2。P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義，即可確定為顯著性因素[6]。表2顯示，回歸模型的P為0.048 1（<0.05），表明Plackett-Burman試驗設(shè)計的因素在所選取的水平范圍內(nèi)對柴油降解率的影響顯著。同時，F(xiàn)eSO4濃度（P為0.016 1）、NH4NO3濃度（P為0.030 6）和轉(zhuǎn)速（P為0.035 7）是影響柴油降解率的主要因素。故在下一步響應(yīng)面分析中，重點考慮這3個因素的最優(yōu)水平。

2.2 顯著影響因子的優(yōu)化

利用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株Salinicola sp. W1對柴油的降解條件。以FeSO4濃度（A）、NH4NO3濃度（B）、轉(zhuǎn)速（C）作為優(yōu)化因子，以柴油降解率為響應(yīng)值，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3和表4。

利用軟件Design-Expert對試驗結(jié)果進(jìn)行二次線性回歸分析，得到柴油降解率Y對自變量FeSO4濃度（A）、NH4NO3濃度（B）、轉(zhuǎn)速（C）的二次多項式回歸方程：

Y=0.94-0.028A-0.009 09B-0.005 95C-0.007AB+0.000 75AC-0.012BC-0.025A2-0.033B2-0.034C2 （3）

由上式可以看出FeSO4濃度、NH4NO3濃度和轉(zhuǎn)速這3個因素對柴油降解率的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是存在交互作用，因此采用單變量考察會產(chǎn)生誤差。

表5的模型方差分析顯示，回歸模型的F為14.83，P為0.000 1（<0.05），表明該二次方程模型顯著。失擬項（Lack of fit）的P不顯著（0.597 8），說明該方程比較可靠。模型方程中A，A×A，B×B，C×C的P均小于0.05，再次證明FeSO4濃度、NH4NO3濃度和轉(zhuǎn)速是影響柴油降解率的顯著因素。相關(guān)系數(shù)R2能夠反映模型與試驗值的擬合程度，一般認(rèn)為大于0.80較好[6]。本模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.930 3，顯示該模型對試驗中93.03%的情況可以解釋，即預(yù)測模型對試驗擬合情況較好。偏差系數(shù)表示試驗的精確度，偏差系數(shù)越大，試驗的可靠性就越低。本試驗的偏差系數(shù)僅為2.19%，說明試驗操作可信。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，可以反映各因素相互作用對響應(yīng)值的影響。利用Design-Expert軟件得出上述3個因子間相互作用的3D響應(yīng)曲面圖（圖1）。經(jīng)軟件預(yù)測得出菌株Salinicola sp. W1降解柴油的最優(yōu)條件為FeSO4 0.1 mg/L、NH4NO3 0.7 g/L和轉(zhuǎn)速118 r/min，預(yù)測該條件下柴油降解率可達(dá)到94.46%。在上述最優(yōu)條件下，3次重復(fù)試驗得到柴油降解率的平均值為95.20%，與預(yù)測值非常接近，證實了模型的有效性。

3 小結(jié)與討論

前期從石油污染環(huán)境中分離到一株可產(chǎn)生物表面活性劑的棲鹽田菌Salinicola sp. W1，該菌屬在石油修復(fù)中的應(yīng)用尚屬空白。因此，本研究結(jié)合Plackett-Burman設(shè)計與響應(yīng)面法，以柴油降解率為響應(yīng)值，柴油降解培養(yǎng)基和降解條件進(jìn)行了優(yōu)化。Plackett-Burman試驗表明，F(xiàn)eSO4濃度、NH4NO3濃度和轉(zhuǎn)速對柴油降解具有顯著影響。并通過響應(yīng)面法獲得了這3個因素的最優(yōu)水平為FeSO4 0.1 mg/L、NH4NO3 0.7 g/L、轉(zhuǎn)速118 r/min，最優(yōu)水平下Salinicola sp. W1的柴油降解率可達(dá)95.2%。后續(xù)將進(jìn)一步研究Salinicola sp. W1的柴油降解機(jī)理，如生物表面活性劑的類型、性能及作用等，以加快該菌株在高鹽環(huán)境下柴油修復(fù)中的應(yīng)用。

柴油是一種由烷烴、芳烴和脂肪物質(zhì)組成的復(fù)雜混合物，由于其中大部分化合物在水中溶解度低，嚴(yán)重限制了柴油中烴類的生物可降解性[2]。因此高效柴油降解菌的分離、篩選和降解條件優(yōu)化是柴油生物修復(fù)技術(shù)的關(guān)鍵。目前國內(nèi)外已篩選到的柴油降解微生物主要為假單胞菌屬Pseudomonous[11]、不動桿菌屬Acinetobacter[12]、芽孢桿菌屬Bacillus[3]和紅球菌屬Rhodococcus[13]等，這些菌大多具有生物表面活性劑生產(chǎn)能力。本研究采用的棲鹽田菌Salinicola sp. W1，是前期從石油污染環(huán)境中分離到的生物表面活性劑生產(chǎn)菌。目前國內(nèi)外對棲鹽田菌的特性及用途的研究僅有零星報道，且其在石油修復(fù)中的應(yīng)用尚屬空白。因此，本研究考察了菌株Salinicola sp. W1的柴油降解特性，旨在為柴油的生物修復(fù)提供新型的微生物資源。

生物表面活性劑具有增溶、乳化等作用，能增加烴類化合物在水中的溶解度，從而顯著提高微生物對柴油污染物的降解效率[4]。多數(shù)研究認(rèn)為，生物表面活性劑可通過兩種機(jī)制促進(jìn)微生物對烴類物質(zhì)的利用[14]：一是生物表面活性劑的乳化作用將烴類化合物大液滴分散成小液滴，增大了烴與水相以及細(xì)胞的接觸面積。二是生物表面活性劑作用于微生物細(xì)胞后，增大了細(xì)胞表面的疏水性，有利于烴類物質(zhì)進(jìn)入微生物胞內(nèi)從而被吸收轉(zhuǎn)化。王春艷等[15]考察了一株石油降解菌的降解特性，發(fā)現(xiàn)分布在表層的油膜首先分散成小顆粒油滴懸浮于培養(yǎng)液中，并用光學(xué)顯微鏡觀察到大量的石油降解菌吸附在油滴表面，降解后期油滴逐步被乳化成白色的絮狀物，這些現(xiàn)象說明是菌株產(chǎn)生的表面活性劑的乳化效果。本研究在菌液培養(yǎng)過程中也觀察到了類似的現(xiàn)象，但Salinicola sp. W1生產(chǎn)的表面活性劑對其細(xì)胞疏水性的影響還有待于進(jìn)一步研究。

環(huán)境因子（溫度、轉(zhuǎn)速、pH、無機(jī)營養(yǎng)及油濃度等）對微生物的柴油降解效率有重要影響，但不同菌株對柴油降解的影響因素差異較大[11，12，16]。因此優(yōu)化微生物的降解條件和產(chǎn)生表面活性劑的發(fā)酵條件，對提高柴油降解效率具有重要意義。本研究結(jié)合Plackett-Burman設(shè)計與響應(yīng)面法，以柴油降解率為響應(yīng)值，對柴油降解培養(yǎng)基和降解條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果顯示，培養(yǎng)基組分FeSO4、NH4NO3和轉(zhuǎn)速是柴油降解的顯著影響因素，且FeSO4濃度為負(fù)效應(yīng)。王建偉等[17]和Chen等[18]優(yōu)化了培養(yǎng)基組分對菌株生產(chǎn)表面活性劑的影響，均發(fā)現(xiàn)FeSO4濃度是重要的影響因素。且王建偉等[17]的研究也證實FeSO4濃度對柴油降解具有負(fù)效應(yīng)，因此添加合適濃度的Fe2+能夠促進(jìn)表面活性劑的生物合成，濃度過高反而會抑制柴油降解。氮源是影響微生物生長的重要因子，劉偉等[19]考察了不同氮源對柴油降解菌B26生長的促進(jìn)作用，發(fā)現(xiàn)無機(jī)氮源比有機(jī)氮源更有利于石油烴的降解。這可能是因為有機(jī)氮源可同時作為碳源，優(yōu)先于石油烴被利用，從而降低了石油烴的降解效率。單大鵬等[20]以乳化系數(shù)為響應(yīng)值對一株脂肽產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，也發(fā)現(xiàn)NH4NO3是影響脂肽型表面活性劑的顯著因素。王鑫等[21]利用外加氮源強(qiáng)化菌株對石油的降解，證明復(fù)合型氮源NH4NO3可通過增加生物量和提高細(xì)胞表面疏水性來改進(jìn)石油降解效果。轉(zhuǎn)速是發(fā)酵過程的外部因素，反映了菌體與營養(yǎng)物的接觸程度及通氣量。朱震等[22]也報道轉(zhuǎn)速是影響生物表面活性劑合成的顯著因素。

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