短小芽孢桿菌阿魏酸酯酶的分離純化及性質研究

摘要：通過硫酸銨沉淀、離子交換層析和疏水層析，對短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）發酵液中的阿魏酸酯酶進行分離純化，并測定其部分酶學性質。結果表明，阿魏酸酯酶的純化倍數為5.06，回收率達到14.8%。該酶的相對分子質量約為28.6 ku；最適反應溫度為50 ℃，最適pH為5.8，在40～45 ℃和pH 5.8～8.2都能保持很高的穩定性。K+、Co2+、Ca2+和DTT對酶活有明顯的促進作用，而Cu2+、乙醇和苯甲基磺酰氟嚴重抑制了其酶活。以阿魏酸甲酯為底物，測得Km為0.25 mmol/L，Vmax為6.27 U/（min·mg）。

關鍵詞：短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）；阿魏酸酯酶；純化；性質

中圖分類號：R284.2；R378.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）10-2611-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.040

Abstract： Extracellular ferulic acid esterase（FAE） from Bacillus pumilus was purified by ammonium sulfate precipitation， ion-exchange chromatography and Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow column. FAE was purified 5.06 fold as shown in SDS-PAGE， the recovery was 14.8% and the molecular weight estimated to be about 28.6 ku. The optimum temperature for FAE was 50 ℃ and the optimum pH was 5.8 respectively， and activity at temperature of 40 to 45 ℃ and pH 5.8～8.2 was high and stable. The enzymatic activity was activated by K+， Co2+， Ca2+ and DTT， whereas it was completely inhibited by Cu2+， ethanol and phenyl methane sulfonyl fluoride（PMSF）. The Km against methyl ferulate was 0.25 mmol/L and Vmax was 6.27 U/（min·mg）.

Key words： Bacillus pumilus； ferulic acid esterase； purification； property

阿魏酸酯酶（Ferulie acid esterase，FAE）又稱肉桂酸酯酶，屬于半纖維素降解酶系，其主要功能是水解阿魏酸與多糖連接的酯鍵[1]。阿魏酸酯酶的來源廣泛，目前發現產FAE主要來源于真菌黑曲霉（Aspergillus niger）、嗜熱側孢霉 （Sporotrichum thermophile）、青霉類（Penicillium）、米曲霉（Aspergillus oryzae）等，還有部分來自細菌和放線菌。不同來源的FAE其理化性質、空間結構和催化機制都有著很大的差異。

中國是農業大國，糧食加工業每年都要產生大量副產品（啤酒糟、麥麩、玉米麩），利用阿魏酸酯酶和阿拉伯木聚糖酶聯合作用，打斷阿魏酸與細胞壁中多糖的交聯，可以獲得阿魏酸和低聚木糖等重要的功能性食品基料。在飼料工業、造紙工業、藥品等方面同樣有廣泛的應用[2-5]。

本研究從短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）發酵液中分離純化阿魏酸酯酶，并研究其部分酶學性質，旨在為進一步降解農副產品得到阿魏酸等有價值物質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

短小芽孢桿菌采用PDA斜面培養基保存；阿魏酸甲酯（MFA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、反式阿魏酸標準品、牛血清白蛋白（BSA）：Sigma公司。

1.2 培養基及培養條件

發酵培養基（g/L）：燕麥木聚糖（Xylan）10.0、去淀粉麥麩（DSWB）30.0、胰蛋白胨4.0、酵母粉2.0、K2HPO4 3.0、NaCl 2.0。裝液量為300 mL三角瓶75 mL，初始pH 7.0，按5%（V/V）接種量，于45 ℃、200 r/min，培養48 h。

1.3 阿魏酸酯酶酶活測定

采用HPLC法[6]測定標準物阿魏酸：用甲醇配制50 mg/mL標準物阿魏酸，避光保存。色譜條件：C18柱；檢測波長320 nm；柱溫30 ℃；流動相為甲醇∶水=70∶30（V/V）；流速為1 mL/min；進樣量為20 μL。

FAE酶活測定[7]：在緩沖液A（pH 6.0 50 mmol/L檸檬酸-磷酸鹽）中加入適量的酶液和底物MFA，于50 ℃反應20 min，煮沸終止反應，離心取200 μL上清液，加800 μL甲醇提取，取20 μL上清液進行HPLC檢測。FAE酶活定義：1個酶活力單位（U）是指在酶最適條件下，水解MFA 1 min內產生1 mol阿魏酸所需要的酶量。

1.4 阿魏酸酯酶的純化

1.4.1 硫酸銨的沉淀 將菌液以5%接菌量接種到發酵培養基中，于45 ℃培養48 h，8 000 r/min離心10 min，4 ℃收集上清液，獲得胞外酶液。利用硫酸銨沉淀法濃縮酶液，放入4 ℃冰箱中，靜置過夜。 4 ℃、8 000 r/min離心30 min，棄去上清液，用4 mL緩沖液A重懸沉淀。透析處理重懸液，得到初步純化和濃縮的胞外粗酶液Ⅰ。

1.4.2 DEAE-Sephacel陰離子交換柱層析 DEAE-Sephacel陰離子交換柱（2.5 cm×20 cm）預先用緩沖液A平衡。將粗酶液Ⅰ小心上柱，用緩沖液A洗脫至OD280不變，然后用10倍柱體積含0～0.6 mol/L NaCl的緩沖液A進行梯度洗脫，流速2 mL/min，分步收集活性峰洗脫液，透析、濃縮得到粗酶液Ⅱ。

1.4.3 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水層析

Phenyl Sepharose 6 Fast Flow層析柱（0.5 cm×7.5 cm）預先用含0.1 mol/L（NH4）2SO4的緩沖液A平衡。將粗酶液Ⅱ小心上柱，用緩沖液A洗脫至OD280不變，然后用含1.0 mol/L（NH4）2SO4的緩沖液A進行梯度洗脫，流速1 mL/min，分步收集活性峰洗脫液，透析，凍干，-20 ℃保存。

1.5 阿魏酸酯酶酶學性質研究

1.5.1 最適反應溫度和溫度穩定性的測定 在30～70 ℃范圍內，每隔5 ℃測定酶活，反應條件為pH 6.0，20 min。以最高酶活為100%，作溫度曲線。溫度穩定性的測定：將酶液置于45、50、55 ℃下保溫0、10、20、30、40、50、60 min，加入底物于50 ℃，pH 6.0測定殘留酶活，以保存于冰浴中的酶活為100%，作溫度穩定性曲線。

1.5.2 最適反應pH和pH穩定性的測定 最適pH的測定：于不同的pH條件下分別測定酶活，以酶活最高為100%，作pH曲線。pH穩定性的測定：將酶液置于不同pH緩沖液中，在45 ℃保溫1 h，再加入底物測定殘留酶活，以冰浴保存的酶在相對應的pH條件下的酶活為100%。所用緩沖液：50 mmol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 4.5～8.0），50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0～9.0）。

1.5.3 不同添加物的影響 在反應體系中分別加入不同濃度的金屬離子、有機溶劑和蛋白質抑制劑等，于45 ℃下保溫1 h后，以不加添加物的酶活為100%，計算相對酶活。

1.5.4 米氏常數的測定 用緩沖液A配制0.1～2.0 mmol/L的阿魏酸甲酯作為底物，然后于50 ℃條件下測FAE的活性。采Lineweaver-Burk作圖法[8]，計算酶的Km、Vmax及Kcat/Km值，其中Kcat=最大反應速度/蛋白質摩爾數。

2 結果與分析

2.1 阿魏酸酯酶的純化

在以燕麥木聚糖和去淀粉麥麩作為碳源的發酵培養基中，誘導短小芽孢桿菌表達胞外FAE。粗酶液經過硫酸銨沉淀、離子層析和疏水層析后，酶液的比酶活達到25.1 U/g，酶活回收率達到14.8%（表1）。純化的酶液經SDS-PAGE凝膠電泳檢測。結果顯示為單一區帶，達到電泳純，該酶的相對分子質量大小約為28.6 ku（圖1）。

2.2 酶學性質研究

2.2.1 最適反應溫度和溫度穩定性的測定 如圖2a所示，阿魏酸酯酶的酶活隨溫度升高迅速增加，反應溫度為45～50 ℃時，相對酶活最大；當溫度超過50 ℃時相對酶活開始下降，當溫度達到55 ℃，其相對酶活為69.3%。

將酶置于45 ℃和50 ℃保溫30 min，仍保留91.3%和40.5%以上的相對酶活，具有較好的熱穩定性，在45 ℃和50 ℃保溫短時間，并有一定程度的活性增大現象，如圖2b所示。隨著溫度增高到55 ℃，阿魏酸酯酶的熱穩定性迅速下降。

2.2.2 最適反應pH和pH穩定性的測定 由圖2c可知，阿魏酸酯酶的最適pH為5.8，最適pH表現很廣的酸堿跨度。由圖2d可知，在pH 5.8～8.2之間，阿魏酸酯酶保持了較高的穩定性。將酶置于pH為5.8的緩沖溶液中，阿魏酸酯酶相對酶活為87.8%。

2.2.3 不同添加物對酶活的影響 金屬離子、有機溶劑及蛋白質抑制劑對酶活的影響見表2。Zn2+、Fe3+和Mn2+對FAE酶活有一定的抑制作用，而Cu2+的抑制作用最顯著；K+、Co2+對酶活有一定的促進作用，Ca2+的促進作用最明顯，比酶活達到194%。添加的有機醇對酶都有一定的抑制作用，其中10%異丙醇完全抑制了該酶活。當吐溫80濃度由1%升到10%時，酶活完全受到抑制。當反應體系中添加2 mmol/L的PMSF，無法檢測到FAE的酶活，而DTT對酶有一定的促進作用。

2.2.4 米氏常數的測定 以不同濃度的MFA為底物，測得Km為0.25 mmol/L，Vmax為6.27 U/（min·mg），催化效率常數Kcat/Km為13.8 L/mmol·s。

3 討論

關于FAE的產生菌種種類也有很多報道，但有關短小芽孢桿菌產FAE報道較少。在以燕麥木聚糖和去淀粉麥麩作為碳源的發酵培養基中，誘導短小芽孢桿菌表達胞外阿魏酸酯酶。FAE的最適pH為5.8，在pH 5.8～8.2保持了較高的穩定性；最適溫度為45～50 ℃，并具有較好的熱穩定性，明顯比來源于Lactobacillius acidophilus阿魏酸酯酶的熱穩定性好，該菌產生的酶在45 ℃保溫5 min，其殘留活性只有最高值的68%[9]。其最適pH和最適溫度與來源于Streptomyces avermitilis（50 ℃，pH 6.0）和Fusariun oxysporum的阿魏酸酯酶（45～55 ℃，pH 7.0）比較接近[10，11]。目前僅有來自嗜熱細菌的FAE的最適溫度為65 ℃，在70 ℃時酶活迅速下降[12]。

PMSF完全抑制著FAE的活性，說明FAE可能含有一個類似ɑ/β水解酶催化結構域的結構[13]。金屬離子Cu2+對FAE有顯著的抑制作用，與來自細菌C.stercorariumr的FAE一致[12]。楊紅建等[14]的研究發現，4 mmol/L Ca2+和Co2+對FAE有著顯著的抑制作用，而本研究中Ca2+對FAE有著明顯的促進作用，說明不同來源的FAE其酶學性質存在著一定的差異。

由于農副產品細胞壁結構的復雜性，要想充分降解并加以應用，是需要阿魏酸酯酶和多種糖類水解酶共同作用的。目前已從該短小芽孢桿菌克隆產生多種半纖維素水解酶[15，16]，結合本研究誘導產生的阿魏酸酯酶，使該菌在降解農副產品得到阿魏酸等重要的生物活性物質上，具有重要的應用潛力。

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