荸薺花粉活力測定及貯藏壽命研究

摘要：為了解荸薺[Heleocharis dulcis （Burm. f.）Trin. ex Hensch.]花粉生活力和最佳體外萌發條件，分別采用I2-KI、TTC、MTT染色法和離體培養基萌發法對荸薺花粉活力進行了測定，并初步研究了荸薺花粉在常溫（25 ℃）條件和低溫（4 ℃）貯藏條件下活力變化的動態。結果表明，MTT染色法測定結果與離體萌發法最接近，最適宜荸薺花粉活力的快速檢測；離體萌發法適宜培養基配方為1%蔗糖+50 μg/mL硼酸；荸薺花粉在常溫條件下50 min活力降至0.29%的低水平，在低溫條件下5 h后完全失去活力。

關鍵詞：荸薺[Heleocharis dulcis（Burm. f.） Trin. ex Hensch.]；花粉活力；測定方法；貯藏壽命

中圖分類號：S645.3+42 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）10-2564-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.028

Abstracts： To study the pollen viability and in vitro germination conditions of Heleocharis dulcis（Burm. f.） Trin. ex Hensch.， viability of H. dulcis pollen was determined by three testing staining methods including I2-KI， TTC， MTT and in vitro culture method. Dynamic changes of in vitro pollen germination rate under the storage condition of 25 ℃ and 4 ℃ was compared. The result indicated that the pollen dyed rate of MTT staining method was similar to the in vitro germination rate， thus the MTT staining method is suitable for fast test of the pollen viability of H. dulcis. The best medium for in vitro pollen germination of H. dulcis was 1% sucrose + 50 μg/mL boric acid. The in vitro pollen germination rate of H. dulcis decreased to 0.29% when stored at 25 ℃ for 50 min， while decreased to 0 when stored at 4 ℃ for 5 h.

Key words： Heleocharis dulcis （Burm. f.）Trin. ex Hensch.； pollen viability； determination method； storage life

荸薺[Heleocharis dulcis（Burm. f.）Trin. ex Hensch.]為莎草科（Cyperaceae）荸薺屬（Heleocharis R. Br.）多年生草本植物，其以球莖供食用，生食、熟食皆宜，是一種重要的水生蔬菜之一。目前，中國荸薺栽培面積約為3.5萬hm2，年產量75萬t左右[1]，荸薺栽培對于農民增收、農業增效發揮了重要作用。國內各地荸薺產區栽培的荸薺品種多為地方品種，鮮見有荸薺選育品種；荸薺育種多利用自然變異采用單株系選的方法進行，或者利用荸薺組織培養過程中產生的變異經單株選育而成，育種方法單一。開展荸薺人工雜交育種研究已成為業內共識，但相關報道較少。荸薺花粉活力高低對雜交育種成敗和效率有著重要的影響，在荸薺雜交前進行荸薺花粉活力測定和花粉貯藏壽命調查，可有效提高雜交效率。目前尚未見荸薺花粉測定方法和花粉保存壽命研究的報道，為此課題組開展了荸薺花粉活力測定方法比較試驗，同時觀察和分析荸薺花粉在離體室溫（25 ℃）和低溫（4 ℃）條件下的活力變化規律，以期為荸薺雜交育種提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

荸薺花粉采集于湖北地方品種沙洋荸薺，在早晨8：00采集花藥完全伸出小花、但尚未散粉的花序若干，迅速帶回實驗室，用鑷子捏取荸薺花序中部花藥1個，置于載玻片上靜置20 min，用于花粉活力測定方法試驗；花粉壽命測定試驗取樣方法同此。

1.2 花粉活力測定

1.2.1 培養基發芽法 液體培養基參照胡適宜[2]提出的配方，經預備試驗初步確定蔗糖和硼酸的濃度范圍，按照表1組合配制9個液體培養基處理。將載玻片花藥加1～2滴液體培養基，用鑷子輕搗，花粉散于培養基液體后夾出花藥，置室溫下1 h后，顯微鏡下觀察3個視野，凡是出現花粉管伸出即認為發芽。試驗采用隨機區組設計，重復3次。

1.2.2 I2-KI染色法 于載玻片花藥加1～2滴I2-KI溶液（將0.3 g碘和1.3 g碘化鉀溶解于100 mL去離子水中）[3]，用鑷子輕搗使花粉散出，夾出花藥后蓋上載玻片，置于35 ℃恒溫箱中30 min，然后在顯微鏡下觀察不同的3個視野，凡是染成藍色者為有活力的花粉。觀察3個制片（重復3次），統計平均染色率。

1.2.3 TTC染色法 于載玻片花藥加1～2滴0.5% TTC溶液（稱取0.5 g TTC，加入少許95%乙醇使其溶解后，用去離子水稀釋至100 mL）[4]，用鑷子輕搗使花粉散出，夾出花藥后蓋上載玻片，置于35 ℃恒溫箱中30 min，然后在顯微鏡下觀察不同的3個視野，凡是染成紅色者為有活力的花粉。觀察3個制片（重復3次），統計平均染色率。

1.2.4 MTT染色法 于載玻片花藥加1～2滴1% MTT溶液（稱取0.1 g MTT，溶解于10 mL配制好的5%蔗糖溶液中）[5]，用鑷子輕搗使花粉散出，夾出花藥，其風干后再復滴1滴，待再次風干后置顯微鏡下觀察不同的3個視野，凡是花粉粒邊緣變黑、中心變玫紅色者為有活力的花粉。觀察3個制片（重復3次），統計平均染色率。

1.3 花粉壽命測定

設置常溫（25 ℃）離體貯藏和低溫（4 ℃）離體貯藏試驗。取田間采回后的樣品分為2份，1份置室溫，另1份置4 ℃冰箱保存，每隔固定時間（常溫離體壽命試驗間隔10 min，低溫離體壽命試驗間隔1 h），用鑷子取荸薺花序中部花藥2個，置于載玻片上，加1～2滴上述篩選出的液體培養基，置室溫下1 h后，顯微鏡下觀察3個視野，凡是出現花粉管伸出即認為發芽，觀察3個制片（重復3次）。

1.4 數據處理

試驗所得數據均取平均值，統計分析采用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 10.5軟件處理、制表、作圖，并進行方差分析；利用鄧肯氏新復極差檢驗法（Duncan's new multiple range test，DMRT）進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 花粉活力檢測情況

在液體培養基花粉發芽試驗中，對觀察到的部分花粉粒花粉管伸出、呈乳突狀或者更長者記為有活力，不同配方液體培養基培養條件下荸薺花粉發芽率方差分析結果見表2。從表2可以看出，蔗糖因子和區組間差異顯著（P<0.05），而硼酸因子與組合間差異不顯著（P>0.05），說明蔗糖含量是影響荸薺花粉萌發的主要影響因子，而且在預備試驗中也發現高含量的蔗糖（10%～20%）會使荸薺花粉基本不萌發，所以初步認為荸薺花粉萌發需要低含量的蔗糖，一般1%～5%；進一步的多重比較結果見表3，從表3可看出，蔗糖含量為1%、硼酸濃度50 μg/mL的組合處理發芽率最高，達24.07%，與蔗糖濃度1%、硼酸含量25 μg/mL的處理間差異不顯著（P>0.05），但顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于其他處理。

3種染色法測定的花粉活力情況見表4。由表4可以看出，I2-KI染色法在顯微鏡下的花粉粒分別呈現出藍色和金黃色，花粉粒呈現藍色的比率約為48.3%；TTC染色法在顯微鏡下的花粉粒均現淡黃色，并未出現紅色，初步認為該方法不適合荸薺花粉的活力檢測；MTT染色法部分花粉粒則呈現玫紅色、淡紅色以及透明無色，而且邊緣現藍黑色圈，經過觀察計數統計，呈現玫紅色的花粉粒染色率達28.3%，一般認為染色顏色越深花粉活力越強，淡紅色、透明無色視為活力弱或無活力。

2.2 花粉壽命比較

2.2.1 常溫離體條件下荸薺花粉活力 常溫（25 ℃）離體條件下不同貯藏時間對荸薺花粉發芽率的影響情況見圖1。從圖1可以看出，荸薺花粉在常溫離體條件下其發芽率在前20 min內由14.45%下降到4.79%，下降幅度較大，而后逐漸緩慢降低；50 min后其活力僅為0.29%。由此看來，荸薺在常溫離體條件下，其花粉壽命約在50～60 min，在 30 min內花粉能保持較高的活力。

2.2.2 低溫離體條件下荸薺花粉活力 低溫（4 ℃）離體條件下不同貯藏時間對荸薺花粉發芽率的影響情況見圖2。從圖2可以看出，在低溫（4 ℃）離體條件下，荸薺花粉發芽率在前1 h迅速下降，由10.91%下降到6.07%，降幅近50%；之后的2 h內下降緩慢；在貯藏3 h后又迅速下降，至5 h時荸薺花粉已完全失去活力。由此可以看出，荸薺花粉在低溫（4 ℃）離體條件下，其最長貯藏壽命為5 h，3 h以內則荸薺花粉能夠保持較高的活力。

3 小結與討論

實驗室花粉活力測定方法主要有染色法和離體萌發法；染色法是最簡便、最快捷、最易操作的一種測定方式，但由于不同作物的花粉自身特性（如花粉壁的厚薄、花粉外壁的組成物質、細胞質含量、質膜完整性、花粉內各種酶活性的強弱等）不同，不同染色方法測定花粉活力的準確性差異較大；而離體萌發法測定花粉活力最直觀、最準確。試驗以離體萌發法測定的結果為對照，比較了I2-KI、TTC和MTT染色法應用于荸薺花粉活力的適用性，結果表明，I2-KI雖能夠使荸薺花粉染成藍色，但測定結果較離體萌發法高出1倍以上，部分含有淀粉而無活力的花粉亦被染成藍色，所以采用該方法測定的荸薺花粉活力誤差較大。TTC染色法將花粉染成顏色很淡的黃色，不易區分染色花粉粒與無色花粉粒，筆者認為該方法不適用于荸薺花粉活力的測定。MTT染色法能夠很清晰染色，并且可區分花粉活力強弱的染色深淺，測定的結果亦與離體萌發法結果最接近，因此筆者認為MTT染色法最適合荸薺花粉活力的測定。在花粉離體萌發培養中，蔗糖起著維持花粉與培養基之間滲透平衡的作用，也是花粉萌發的主要營養物質供應和能量來源，不同植物花粉萌發的適宜蔗糖濃度有所不同，一般為5%～15%[6]，但通過此次試驗發現荸薺花粉萌發宜采用1%的低蔗糖濃度。硼酸的作用是促進花粉管的萌發，不同的植物在濃度上差別也較大[7-10]，試驗發現，硼酸可明顯促進荸薺花粉萌發，濃度宜為50 μg/mL。

試驗結果表明，荸薺花粉保持活力的時間較短，其在常溫條件下50 min時活力僅為0.29%；即使在低溫條件下，在前3 h內可保持較高活力，而在貯藏5 h后完全失去活力。因此筆者認為，荸薺雜交人工授粉時宜在采集到花粉后20 min內進行；若花粉在低溫貯藏條件下，則應在3 h內進行授粉。花粉貯藏條件與溫度、濕度和光照等因素相關，但試驗僅研究了荸薺花粉在4 ℃低溫條件下的貯藏壽命長短，而且在此條件下的貯藏壽命尚不能達到異地授粉或者花期不遇親本授粉的要求，因此還有待進一步開展荸薺花粉超低溫、不同濕度和光照條件下貯藏壽命長短的研究，以期延長其貯藏壽命。

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