影響核桃油包水乳液物理與氧化穩定性的因素分析

易建華 孫藝飛 朱振寶 董文賓 黃 鑫

影響核桃油包水乳液物理與氧化穩定性的因素分析

易建華1孫藝飛1朱振寶1董文賓1黃 鑫2

（陜西科技大學食品與生物工程學院1，西安 710021）
（焦作市糧油質量安全檢測中心2，焦作 454003）

以核桃油為油相，以聚甘油聚蓖麻油酸酯（PGPR）為表面活性劑，制備油包水（W／O）乳液，乳液于55℃避光保存，每隔1 d測定乳液液滴的平均粒徑及粒徑分布等物理特性，同時檢測乳液初級氧化產物—脂質氫過氧化物與次級氧化產物—己醛，探究水油界面與表面活性劑用量對W／O乳液穩定性影響。結果表明，在W／O乳液，油水界面存在加速乳液脂質氧化，降低了乳液氧化穩定性。0.3%～1.0%PGPR，表面活性劑含量增大顯著降低乳液液滴粒徑，提高乳液物理穩定性；同時，表面活性劑含量增加顯著推遲了初級與次級產物形成延遲期，提升了乳液脂質氧化穩定性。W／O體系中過量表面活性劑與脂質氫過氧化物相互作用，增加了脂質氫過氧化物在油相的濃度，并降低了該初級氧化物的分解速率。

油水界面 油包水乳液 油脂氧化 表面活性劑

脂質氧化導致食品品質包括味覺、質地、保質期、外觀和營養價值等劣變［1］。在某些食品中（例如干酪、臘肉、火腿等），有限的脂質氧化賦予食品特殊的風味［2］。但是，在大多數食品中，脂質氧化產生異味，并生成具有潛在毒性的反應產物［3］，因此，脂質氧化應盡量避免。近年來臨床醫學研究發現攝入適量的多不飽和脂肪酸PUFA（如ω-3、ω-6系列不飽和脂肪酸）對人體健康有益［4］。但PUFA極易氧化，這種特性制約了不飽和脂肪酸在食品中的應用。

油脂一般以水包油（O／W）乳液或者油包水（W／O）乳液形式存在于食品體系，其中，O／W 乳液是油脂存在于食品的主要形式，近幾十年對油脂氧化穩定性的研究也多集中于該體系［5］。現已證實，由于水油界面的存在加速了油脂與水相促氧化劑相互作用，導致油脂在O／W體系的氧化穩定性低于純油體系。目前，相關學者專家指出，不飽和油脂氧化形成的脂質氫過氧化物具有表面活性，該氫過氧化物主要定位于油水界面，并與水相促氧化劑如過渡金屬離子相互作用，形成高活性烷氧自由基，該自由基重新攻擊未氧化的不飽和脂肪酸，從而加速油脂氧化［6］。

油水具有不同的密度，因此，乳狀液傾向分離成油層（低密度層）于水層（高密度層）之上的體系，以減少油水接觸面積［7］。為制備在一定時間內（數周、數月或數年）動力學相對穩定的乳狀液，乳液在均質時需使用乳化劑。在均質化過程中，乳化劑吸附到油水界面，促使液滴進一步微細化，形成一層保護膜，防止液滴的聚集。在食品工業中最常用的乳化劑有兩性蛋白質、磷脂和小分子表面活性劑。通過乳化劑形成的界面膜，其特性對乳液脂質氧化的速率具有很大的影響。因此，食品科學家常通過使用不同的乳化劑來操縱界面膜特性，以提高乳液的氧化穩定性。然而，乳液均質化后，有顯著數量的非吸附性表面活性劑分子存在于O／W乳液水相，超過其臨界膠束濃度（CMC），未吸附的表面活性劑形成膠束。膠束是表面活性劑分子的聚集體，其中，非極性尾部朝內，極性頭部朝外。表面活性劑膠束能把非極性分子引入疏水核心，把極性或兩性分子引入表面活性劑圍成的柵欄層中。因此，膠束能夠溶解脂類、抗氧化劑或促氧化劑，改變體系的氧化穩定性［8］。現研究證實，表面活性劑膠束與降低O／W乳液的脂質氧化速率，其潛在機制在于表面活性劑膠束能降低促氧化劑活性或促使脂質氫過氧化物從油核轉移至連續相［9］。

W／O乳液（如黃油、人造奶油）是油脂存在于食品的重要形式。基于油水界面以及表面活性劑濃度對O／W乳液脂質氧化穩定性影響，本課題以富含PUFA核桃油為原料，重點研究上述因素對W／O體系脂質氧化速率是否也存在影響，并闡明其機理，以期為含PUFA油脂（如核桃油、亞麻籽油）應用于W／O食品乳液提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

核桃油：自制。

異丙苯過氧化氫，十六烷，氯化鋇，氯化鈉，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，正己烷，甲醇，正丁醇，孟加拉紅：西格瑪化學試劑有限公司；聚甘油聚蓖麻油酸酯（PGPR，4175）：美國Palsgaard。所有試劑為分析純。

1.2 設備與儀器

M133／1281-0便攜式均質攪拌器：美國Biospec Products有限公司；ECLIPSE80i光學顯微鏡：尼康機械有限公司；WX Ultra 80超高速離心機：美國Thermo scientific公司；粒徑動態激光散射儀：美國馬爾文機械有限公司；高壓微射流均質機：美國Microfluidics公司；GC-17A氣相色譜：日本Shimadzu公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳液的制備和儲存條件

前期試驗研究表明，乳液中表面活性劑PGPR質量分數為0.3%時，可獲得穩定的乳狀液體系，因此，采用核桃油與0.3%PGPR混合制備油相。2%水相（20 mmol／L pH 3.0的磷酸鹽緩沖液）逐漸滴加于油相，由便攜式均質攪拌器以2 000 r／min攪拌2 min，獲得粗乳液，隨后用微射流均質機以120 MPa壓力均質3次，獲得W／O乳液。制備的乳液樣品轉移至10 mL GC小瓶，墊片采用聚四氟乙烯／硅氧烷復合材料，并用鋁蓋密封，樣品于55℃恒溫室避光保存。每天取不同處理3瓶樣品，檢測脂質氫過氧化物和己醛的形成。研究乳化劑（表面活性劑）用量對W／O乳液氧化穩定性影響的試驗，制備乳液時，加入的乳化劑PGPR占乳液質量分數分別為0.3%、0.5%、1.0%，所有乳液制備參照上述方法。

1.3.2 乳液物理性質的測定

分析前輕輕攪拌乳液，以確保乳液體系中水滴均勻分散。滴加乳液于載玻片，加蓋蓋玻片。利用光學顯微鏡觀察乳液結構，該顯微鏡連接數字圖像處理軟件CCD照相機，可動態獲取乳液液滴分布的圖像資料。采用粒徑動態激光散射儀于25℃測定水滴粒徑，測定方法參照Choi等［10］試驗方法，具體方法：乳液樣品用十六烷稀釋到4倍，（十六烷折射率1.434，黏度為3.13 mN s／m2），混合均勻，并立即轉移至3 mL激光散射玻璃皿，測定乳液液滴粒徑的大小。微滴大小為散射強度加權平均直徑，以z-average表示。每處理重復3次，在室溫下測定樣品。

1.3.3 脂質氧化物的測定

1.3.3.1 脂質氫過氧化物的測定

脂質氧化初級產物以脂質氫過氧化物含量表示。依據Panya等［11］測定脂質氫過氧化物的方法，并做一些改進：20μL乳狀液稱重，并添加于2.8 mL甲醇／正丁醇混合液中（甲醇／正丁醇＝2∶1，V／V），然后加入15μL 3.94 mol／L硫氰酸銨和15μL亞鐵溶液（由0.132 mol／L 氯化鋇和0.144 mol／L 硫酸亞鐵配制）。混合液旋渦混合，置于室溫下反應20 min后，用分光光度計于510 nm處測定吸光度。以過氧化枯烯（異丙苯過氧化氫）為標準品繪制標準曲線，并計算出氫過氧化物的含量。

1.3.3.2 己醛測定

脂質氧化次級產物以頂隙己醛含量表示。根據Panya等［11］的方法，采用GC-17A氣相色譜測定己醛濃度：將以聚四氟乙烯／硅氧烷為密封墊并用鋁蓋加蓋的玻璃瓶中的1 mL樣品加熱到55℃保持8 min。氣相色譜分析條件固相：50／30 μmol／L DVB／Carboxen／PDMS；色譜柱：Supelco DB-1 柱，30 m ×0.32 mm。載氣為氦氣，流速為15 mL／min。纖維針注入小瓶，吸取揮發物2 min，然后轉移到噴油器端口（250℃），注射3 min。注射端口是按照分流模式操作，分流比為1∶7。檢測器：火焰電離檢測器，檢測溫度250℃。以己醛標準品繪制標準曲線，采用峰面積計算己醛含量。

1.3.4 脂質氫過氧化物的制備

脂質氫過氧化物制備前，采用Panya等［11］試驗方法對核桃油進行脫極性處理，以除去核桃油自身含有的脂質氫過氧化物以及游離脂肪酸等極性成分。脂質氫過氧化物制備依照Nuchi等［9］的方法，有所改動，具體方法：50 mg單線氧發生劑孟加拉紅與10 g脫極性核桃油混合。混合油脂置于4℃下，用90 W白熾燈照射12 h，制備脂質氫過氧化物，其濃度大約為0.2 mmol／g油。頂空己醛檢測顯示未有己醛產生，表明脂質氫過氧化物尚未分解。

1.3.5 脂質氫過氧化物油相分布測定

分別將0.3%、0.5%、1.0%PGPR 加入中碳鏈脂肪酸酯（MCT），制備油相。MCT具有高度的氧化穩定性，在試驗期間不會氧化降解生成脂質氫氧化產物，因此采用MCT替代核桃油進行脂質氫過氧化物油相分布測定試驗。按照1.3.4方法制備過氧化脂，將2.0%（質量分數）水相加入含不同濃度的PGPR混合油相中。將EDTA（50μmol／L）加入水相以防止乳液脂質氫過氧化物的分解。含脂質氫過氧化物的乳液制備采用1.3.1方法。乳液于室溫攪拌1 h，5 g乳液于4 ℃下46 000 r／min 離心30 min，移取0.2 g連續相，測定氫過氧化物的濃度，同時測定相未分離前乳液的脂質氫過氧化物的濃度。

1.3.6 脂質氫過氧化物分解測定

采用硫酸亞鐵加速氫過氧化物分解，具體方法如下：采用1.3.1方法制備分別含質量分數0.3%、0.5%、1.0%PGPR 的MCT 油相，將過氧化脂（含乳液質量分數2.0%）加入上述含不同PGPR濃度的混合脂質相；于水相加入0.2 mmol／L硫酸亞鐵取代EDTA；制備乳液。乳液在室溫下攪拌平衡1 h，之后每1 h測定氫過氧化物濃度，連續測定6 h。未添加硫酸亞鐵乳液作為空白對照。

1.3.7 統計分析方法

每個樣品重復測定3次，取平均值，數據結果以均值±標準差表示，采用Microsoft excel軟件繪圖，并運用Duncan＇s多重比較進行顯著性檢驗（P＜0.05）。脂質氧化滯后期或延遲期定義為第1個數據點顯著大于0 d氧化指標值。

2 結果與分析

2.1 乳液物理穩定性及影響因素

乳液制備后立即測定乳液液滴粒徑，并在儲藏過程中每1 d測定1次。乳液水滴平均粒徑（z-average）為（319.6 ±16.7）nm，試驗中發現除表面活性劑濃度對乳液液滴粒徑分布和平均粒徑有明顯影響外，其他處理對乳液粒徑沒有顯著性影響。此外，W／O乳液粒徑分布和平均粒徑在試驗期間沒有明顯的變化（數據未顯示）。視覺觀察試驗也表明，乳液在存儲過程中，所有處理沒有相分離現象（數據未顯示）。這說明在該試驗條件下，乳液液滴尚未發生聚結、沉積而失穩。

圖1分為不同表面活性劑用量下W／O乳液水滴平均粒徑及其分布。由圖1可以明顯看出，W／O乳液表面活性劑用量增加導致乳液水滴粒徑顯著降低；另外，乳液制備時，表面活性劑用量不同，水滴粒徑分布產生明顯的差異：表面活性劑（乳化劑）用量較低時（如0.3%、0.5%PGPR），W／O 乳液水滴粒徑為雙峰分布，而表面活性劑含量較高時，乳液粒徑為單峰分布（例如1.0%PGPR）。在試驗研究期間，平均粒徑和粒徑分布沒有明顯變化（如圖1）。含有1.0%PGPR乳液，在室溫下儲存6個月后，沒有相分離現象發生，而0.3%、0.5%PGPR乳液在相同的儲存期出現相分離。Márquez等［12］發現類似現象：PGPR濃度增大能減小W／O乳液水滴粒徑，并提高W／O乳液的物理穩定性。該學者認為，液滴粒徑減小能降低微滴之間的碰撞幾率，進而降低微滴之間的聚結作用。此外，提高PGPR用量能增大乳液的粘度，這也可能導致液滴聚結幾率的降低［13］。

圖1 PGPR用量對W／O乳液粒徑分布影響

2.2 水油界面及對W／O乳液脂質氧化穩定性影響

W／O乳液是油脂存在于食品的重要形式，如同O／W乳液，水的引入使W／O乳液同樣具有油水界面，為研究該水油界面存在對脂質氧化穩定性影響，將占核桃油質量分數2%的水加入其中，檢測含核桃油乳液體系中產生的初級氧化產物-脂質氫過氧化物和次級產物-頂隙己醛含量，結果如圖2所示。

圖2表明，水加入核桃油制備的W／O乳液，體系脂質氫過氧化物和己醛生成率都高于純油體系，如，在核桃油純油體系中，脂質氫過氧化物和己醛形成延遲期分別為16、15 d而水的加入將兩種產物的延遲期都縮短到10 d，表明水的引入加速了脂質氧化。該研究結果有別于Fritsch［14］對W／O體系油脂氧化的闡述，Fritsch認為，由于W／O脂質相表面直接暴露于空氣中，乳液脂質氧化速率類似于純油體系。如前所述，在過渡金屬離子作用下脂質氫過氧化物分解成高活性的自由基是促進O／W體系脂質氧化的主要原因。W／O體系與O／W體系相似，水分的引入同樣使W／O乳液形成油水界面，具有表面活性的脂質氫過氧化物有可能積累于乳液液滴水油界面上，與水相促氧化劑如內源過渡金屬離子相互作用，加速油脂氧化。

圖2 水油界面對W／O乳狀液脂質氧化穩定性的影響

2.3 表面活性劑用量對W／O乳液脂質氧化穩定性影響

O／W乳液表面活性劑的用量對脂質氧化穩定性有很大程度的影響［7］。試驗研究表明，PGPR具有良好的親水親油性，能形成穩定的W／O乳液，因此，本課題以PGPR為表面活性劑，為確定W／O體系中表面活性劑用量是否影響脂質氧化穩定性，將不同用量PGPR（分別為乳液質量分數0.3%、0.5%、1.0%）添加于W／O體系，測定體系脂質氫過氧化物和己醛的形成，結果如圖3所示。試驗研究發現，隨著W／O中表面活性劑用量的增加，乳液水滴粒徑趨于降低，因此油水界面的表面積趨于增大。據Lee等［15］研究，油水界面增大會導致脂質氧化速率降低。但是，圖3結果顯示相反的趨勢：隨著乳液粒徑的降低（即油水界面表面積的增大），脂質氧化穩定性反而提升，這表明在W／O乳液中較高的表面活性劑含量更有利于提高乳液的氧化穩定性。

圖3 PGPR用量對W／O乳狀液脂質氧化穩定性的影響

在O／W體系中，小分子表面活性劑能吸附于乳液液滴表面，直至飽和，油水界面表面活性劑到達飽和后，剩余的表面活性劑將溶于連續相［5］。如果連續相內表面活性劑的濃度超過CMC，表面活性劑以膠束形式存在。這些表面活性劑膠束能結合親脂性或兩親性化合物，從而改變這些分子在乳液油相、水相、油水界面的區位分布，導致乳液脂質氧化穩定性改變。Nuchi等［9］研究發現，表面活性劑膠束體系對具有表面活性的脂質氫過氧化物有增溶作用，使其遠離液滴界面，從而提高乳液脂質氧化穩定性。與O／W體系相反，過量的表面活性劑在W／O體系中形成反膠束。圖3顯示的PGPR較高濃度對W／O乳液的脂質氧化的抑制作用有可能是由于脂質氫過氧化物與過量的PGPR相互作用，形成混合反膠束，使其溶解于連續相，從而降低了脂質氫過氧化物在油水界面濃度。可見，PGPR濃度對W／O乳液氧化穩定性影響有可能與脂質氫過氧化物在乳液不同相之間的分布有關。為證實該假設，本課題采用MCT替代核桃油，制備W／O模擬體系，與體系添加脂質氫過氧化物，測定不同PGPR濃度對脂質氫過氧化物油相分布的影響，結果如圖4所示。

由圖4看出，W／O體系PRGR用量對脂質氫過氧化物在連續相分布具有顯著性影響。隨著PGPR增加，脂質氫過氧化物在連續油相的含量增大。可見，過量PGPR有可能形成反膠束，與兩親性脂質氫過氧化物相互作用，將其從油水界面轉移至反膠束內部，因而進入連續相，導致脂質氫過氧化物在連續油相濃度增加。據此推斷，脂質氫過氧化物在連續油相中濃度的增大可能與PGPR反膠束形成有關。但試驗研究發現，隨PGPR濃度增大，核桃油-水界面張力降低，PGPR濃度增大到2%，油水界面張力仍然有降低趨勢，表明在該體系中，PGPR無固定CMC。然而，當前試驗結果表明，采用0.3%PGPR可以獲得穩定的W／O乳液。因此，過剩的PGPR可能溶于脂質連續相，與脂質氫過氧化物相互作用，形成混合反膠束，從而降低脂質氫過氧化物在油水界面濃度。

圖4 在W／O模擬體系中PGPR用量對乳液連續相脂質氫過氧化物分布的影響

2.4 表面活性劑用量對W／O乳液氧化穩定性影響機理

為進一步探究表面活性劑濃度對W／O乳液脂質氧化影響機理，該研究采用MCT取代核桃油，于油相添加脂質氫過氧化物，于水相添加過渡金屬離子Fe2+，制備W／O模擬體系，測定脂質氫過氧化物的降解速率，結果如圖5所示。

圖5 W／O模擬體系中PGPR用量對Fe2+誘導的脂質氫過氧化物的分解的影響

圖5 清晰顯示：未添加Fe2+的樣品（對照組），在6 h測定期間，脂質氫過氧化物相對穩定，而添加Fe2+的乳液，脂質氫過氧化物濃度都明顯降低，說明水相Fe2+存在加速脂質氫過氧化物的分解。該研究結果進一步說明脂質氫過氧化物具有表面活性，能積累于W／O體系的油水界面，與過渡金屬離子接觸，加速其分解形成自由基。圖5同時表明，表面活性劑用量增加導致脂質氫過氧化物分解速率降低，該結果再次證實：脂質氫過氧化物可以與過量的PGPR相互作用，導致其從油水界面移除，阻礙脂質氫過氧化物與水相過渡金屬離子接觸，從而降低W／O乳液脂質氧化速率。

3 結論

在W／O體系，油水界面存在加速乳液脂質氧化。PGPR用量增大顯著降低乳液水滴粒徑，提高乳液物理穩定性；同時，PGPR含量增加明顯提升乳液脂質氧化穩定性。過量PGPR與脂質氫過氧化物相互作用，增加了脂質氫過氧化物在油相的濃度，并降低了脂質氫過氧化物分解速率。

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Analysis of Factors Influencing the Physical and Oxidative Stability of Water-in-Walnut Oil Emulsions

Yi Jianhua1Sun Yifei1Zhu Zhenbao1Dong Wenbin1Huang Xin2
（School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology1，Xi′an 710021）
（Jiaozuo Testing Center for Grain and Oil Quality Safety2，Jiaozuo 454003）

Walnut oil was applied to prepare the water-in-oil（W／O）emulsions were prepared by applying walnut oil as oil phase，employing polyglycerol polyricinoleate （PGPR）as the surfactant.Emulsions were stored at 55℃ in the dark，and the mean particle size and particle size distributions and the like of drops of emulsions were measured every other day.Meanwhile，the formation of primary oxidation products （lipid hydroperoxides）and secondary oxidation products（headpace hexanal）were examined to evaluate influence of water-oil interface and surfactant dose on the stability of W／O emulsions.The results show that the presence of water-oil interface accelerates the oxidation of emulsion lipids，and reduces the oxidative stability of W／O emulsions.With PGPR at the levels of 0.3%～1.0%，increasing of surfactant content significantly reduces the particle size of drops of emulsions and improves the physical stability of the emulsions.In addition，increasing of surfactant content dramatically prolongs the delay phase between the primary products and secondary products，and improves the oxidative stability of emulsion lipids，The interaction of excess surfactant and lipid hydroperoxides increases the concentration of lipid hydroperoxides in the lipid phase，and results in the reduction of the decomposition rate of such primary oxides.

water-oil interface，water-in-oil（W／O）emulsions，lipid oxidation，surfactant

TS201.2

A

1003-0174（2016）11-0049-06

陜西省科技廳農業攻關（2014K01-10-04）

2015-03-23

易建華，女，1971年出生，博士，油脂與植物蛋白工程

董文賓，男，1951年出生，教授，油脂與植物蛋白工程