微生物強化發酵對米粉品質的影響

李 蕓 楊夢妍 陳小雪 梁建芬 韓北忠

微生物強化發酵對米粉品質的影響

李 蕓 楊夢妍 陳小雪 梁建芬 韓北忠

（中國農業大學食品科學與營養工程學院；食品質量與安全北京實驗室，北京 100083）

采用接種植物乳桿菌（L.p-35）、發酵乳桿菌（L.f-7）、熱帶假絲酵母（C.t-3）、枯草芽孢桿菌（B.s-14）進行強化發酵制作米粉，通過測定發酵后大米及米粉的蛋白、淀粉、直鏈淀粉含量，采用掃描電鏡觀察發酵對大米籽粒外觀結構的影響，并從米粉產品質構、感官品質2方面研究了強化發酵與傳統自然發酵的差別。強化接種L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14（第4組）4種微生物發酵制得的米粉與其他強化發酵組相比，蛋白含量明顯降低，淀粉、直鏈淀粉含量明顯增加。通過掃描電鏡觀察，強化發酵組明顯改變了大米顆粒表面結構。結合質構及感官評定，第4組及自然發酵組制得的米粉品質在彈性、咀嚼性、爽滑感等方面優于其他強化發酵組。綜合各方面評分，第4組在優化大米結構、提高米粉品質方面存在明顯優勢，并結合pH、微生物變化情況，強化發酵有利于加速發酵過程。

米粉 強化發酵 乳酸菌 品質

米粉是一類條狀、絲狀米制品的統稱，在中國有著悠久的傳統和歷史［1］。米粉以早秈稻為主要原料，其生產工藝主要包括浸泡（發酵）、磨漿、蒸坯、擠絲、冷卻等［2］。鮮食米粉的生產過程中采用一定時間的自然發酵，發酵程度完全靠經驗和生產需要確定，這一方面不能保證每次發酵程度的一致性，從而不能保證產品感官品質的一致性；另外，參與自然發酵的微生物種類非常多，為米粉微生物安全的控制帶來一定的難度。

實踐證明經過發酵后制成的食品在口感、風味上都有較大的改善［3］。目前米粉的研究多集中在工藝、成分變化、物化性質等方面，在微生物發酵菌種及發酵機理等方面研究較少，缺乏工業化生產的理論指導，使米粉的現代化發展比較緩慢。

前期研究表明，自然發酵過程是在細菌和真菌的共同作用下完成的［4］，在發酵的過程中，微生物的數量和菌相發生了很大的變化，對于米粉的風味和品質起著很重要的作用。經過微生物計數，其中乳酸菌為優勢菌，其次為酵母菌和一些芽孢菌。

本研究運用本課題組先前從發酵米粉中分離、篩選得到的優勢菌株：植物乳桿菌（L.p-35）、發酵乳桿菌（L.f-7）、熱帶假絲酵母（C.t-3）和枯草芽孢桿菌（B.s-14）進行強化發酵，通過與自然發酵組生產得到的米粉樣品進行對比，研究純種強化發酵對米粉品質的影響，旨在為米粉純種工業化生產及品質調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

早秈米：市售；植物乳桿菌（L.p-35）、發酵乳桿菌（L.f-7）、熱帶假絲酵母（C.t-3）和枯草芽孢桿菌（B.s-14）：本實驗室從傳統發酵工藝的大米浸泡過程中分離、篩選得到，保藏于-80℃冰箱中；直鏈淀粉標品、支鏈淀粉標品：Sigma公司；淀粉酶：江蘇銳陽生物科技有限公司；細菌總數測試片、霉菌酵母測試片：美國3M公司；乳酸細菌培養基（MRS）：北京奧博星生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

SCD500噴金儀：Leica公司；JEM-6700F掃描電鏡：JEOL 公司；TA.XT plus物性測定儀（TPA）：Stable Micro System公司；SPD50自動凱式定氮儀：三品科創公司；SpectraMax M2e自動酶標儀：Molecular Devices公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米粉的制作工藝

根據米粉廠生產實際及成明華［5］的方法，按照工藝制作：原料→浸泡（發酵）→磨漿→蒸坯→擠絲→煮制→冷卻→成品。發酵過程為接種微生物強化發酵，共分為4 組，分別接入L.p-35；L.p-35+L.f-7；L.p-35+L.f-7+C.t-3；L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14。各試驗組菌懸液初始濃度為106cfu／mL，接入量為1%。對照為自然發酵組，按照傳統工藝，不做任何處理，各試驗組于25℃恒溫培養箱中發酵3 d。

1.3.2 發酵液pH 測定

取各組浸泡過程中的溶液，每24 h取1次，用酸度計進行pH測定。

1.3.3 發酵過程中微生物計數

取各組浸泡過程中的樣品25 g，每24 h取1次，放入225 mL無菌生理鹽水中，置于漩渦混勻器上，充分混勻，在超凈工作臺內以10倍稀釋法進行梯度稀釋。選取2個合適的稀釋度，吸取1 mL稀釋液于測試片上，細菌總數、真菌總數的檢測均按照測試片說明操作；乳酸菌采用MRS培養基傾注培養，于30℃培養48～72 h，恒溫培養箱培養后計數。

1.3.4 蛋白質含量測定

蛋白質含量的測定參照GB 50095—2010中的規定進行。

1.3.5 淀粉含量測定

淀粉含量的測定參照GB 5009.9—2008中的規定并做一些改進，分別稱取發酵后的大米、成品米粉2～5 g（精確至0.000 1 g），樣品采用酶水解法進行測定，還原糖含量采用DNS法進行測定。

1.3.6 直鏈淀粉含量測定

分別稱取（0.010 0±0.000 5）g直鏈淀粉和支鏈淀粉標品于燒杯中，加入1 mL無水乙醇使之分散，再加入9 mL的1 mol／mL NaOH溶液，置于沸水浴中煮沸糊化10 min，冷卻后定容到50 mL容量瓶中。配制直鏈淀粉標準溶液，其中乙酸（1 mol／mL）和碘試劑（2%碘化鉀和0.2%碘，m／V）的混合液按1∶4（V／V）在臨用前混合、搖勻。配制后充分混勻靜置20 min，于620 nm處比色并記錄吸光度值。以直鏈淀粉為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制作直鏈淀粉標準曲線。

將浸泡發酵后的大米、成品米粉烘干后粉碎，過60目篩。稱取已過篩的樣品（0.040 0±0.005 0）g于燒杯中，方法同上，冷卻后定容到100 mL容量瓶中。將1.5 mL待測樣品與0.5 mL蒸餾水和5 mL乙酸和碘試劑的混合液混勻后靜置20 min，于620 nm處比色測定，并記錄吸光度值。

1.3.7 微觀形貌特性

干燥好的大米樣品采用噴金儀進行噴金，之后用掃描電鏡觀察大米表面微觀形貌特性。

1.3.8 質構特性測定

采用質構儀TPA模式測定。質構儀探頭選用TA3／100探頭，其他參數設置：測前速度1 mm／s，測試速度0.5 mm／s，測后速度0.5 mm／s，測試距離20 mm，觸及壓力5 g，壓縮比50%。質構TPA指標包括硬度形變、彈性、膠著性和咀嚼性等。

1.3.9 感官評價

由6人對不同組米粉成品進行感官評定，評定在樣品制成10 min內完成。米粉的感官評定主要從香氣、色澤、口感等幾個食用指標進行分析。

1.4 數據分析

試驗重復測定3次，應用SPSS16.0軟件分析，用單因素方差分析ANOVA（one-way analysis of variance），以Duncans多重比較檢驗（Duncans multiple range tests）。試驗結果以均值±標準差表示，P＜0.05時具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 發酵過程pH變化

圖1 強化發酵過程中pH變化

米粉發酵過程主要作用微生物為乳酸菌［4］，乳酸菌代謝產生大量的乳酸，使發酵液處于低pH值水平。研究表明，低pH可以抑制一些致病菌，包括大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等［6-7］，使得發酵食品的安全得到保障。對強化發酵及自然發酵組樣品浸泡發酵液進行了pH測定，結果見圖1。隨著發酵的進行，pH值不斷下降，在發酵第1天pH下降最為明顯，發酵結束時各組pH值均在4.5以下。接種植物乳桿菌L.p-35的發酵液pH高于其他發酵組，這可能是由于強化接種單一乳酸菌在發酵過程中沒有其他微生物的協同作用，發酵緩慢。自然發酵組的發酵液pH下降最為平緩，這可能是由于發酵過程中其他微生物的共同作用，包括酵母菌、霉菌等參與發酵過程，在發酵初期乳酸菌不是優勢菌株所致。其他3組pH值下降趨勢基本一致，在發酵第1天下降最為明顯，發酵后期變化不顯著，說明乳酸菌在發酵過程初期就成為主導的優勢菌，這為強化發酵能縮短米粉發酵過程提供一定的理論依據。并且接種2種乳酸菌的3個發酵組（第2、3、4組）pH明顯低于接種單一乳酸菌組（第1組），低于自然發酵組，說明多菌種強化發酵更低的pH值對于抑制致病菌方面也優于自然發酵組。

2.2 發酵過程中微生物量變化

圖2 發酵過程中微生物量變化

對強化發酵及自然發酵組發酵液測定了微生物量變化情況，結果見圖2。在米粉發酵過程中，乳酸菌是主要優勢菌，其次是酵母菌。乳酸菌和酵母菌在發酵過程中存在共生關系。乳酸菌在酵母菌產生乳酸菌所需的維生素和氨基酸等生長物質的同時創造了一個有益于酵母增殖的酸性環境［8］。因此對發酵過程中微生物量的變化情況進行監測，可以判斷發酵條件對于米粉品質的影響是否有利。

在發酵過程中，菌落總數、真菌總數、乳酸菌總數都隨著發酵時間不斷變化，呈現增長的趨勢。雖然自然發酵組未強化接種乳酸菌，起始乳酸菌數較低，但不同組乳酸菌在發酵結束均達到相同的數量級，成為優勢菌；真菌增長情況可以看出，第3、第4組因強化接種熱帶假絲酵母（C.t-3）而增長較快，但在發酵結束，除自然發酵組較其他組低一個數量級之外，其他強化發酵各組均達到相同的數量級，這可能是由于自然發酵過程中微生物之間相互抑制，生長過慢；菌落總數各組增長情況基本一致。從結果可以看出，乳酸菌在發酵過程中成為優勢菌，達到1011cfu／g。

2.3 強化發酵對蛋白含量的影響

大米中蛋白質質量分數為7%～8%，主要為谷蛋白，其余為白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白。大米中的蛋白質多以與直鏈淀粉結合的形式存在，影響大米粉的理化性質［9］。發酵可顯著降低大米中蛋白質的含量。在發酵前期，蛋白質的減少主要是蛋白溶出引起的，而發酵后期，被微生物利用，導致蛋白質的含量顯著降低［10］。對強化發酵及自然發酵組樣品及制成的成品米粉測定蛋白質含量，結果見表1。

表1 不同發酵條件大米、米粉蛋白質含量

第2～4組浸泡米蛋白質含量顯著低于第1、第5組蛋白質含量（P＜0.05）。說明添加2種及以上微生物強化發酵組在發酵過程中對蛋白質作用明顯，使得大米中的蛋白質分解，被分解為小分子肽甚至氨基酸而溶出。成品米粉蛋白質含量方面，除了第1組高于其他組之外，其他發酵組無差異性。雖然從營養方面講，發酵降低了蛋白含量，但是蛋白含量的降低則起到了純化淀粉、改善淀粉凝膠性能的作用。并且微生物生長離不開碳源、氮源等營養物質，大米中的蛋白是微生物生長所需唯一氮源，因此由于微生物的發酵作用，蛋白含量顯著下降［11］。

2.4 強化發酵對淀粉、直鏈淀粉含量的影響

淀粉是構成米粉凝膠的基礎，其性質與米粉的凝膠性質密切相關。直鏈淀粉糊化后能迅速老化形成凝膠，因此對制作米粉的品質具有決定作用。一般直鏈淀粉含量越高，米粉質地堅實，越耐煮。淀粉是大米的主要成分，研究發現大米自然發酵后淀粉和直鏈淀粉含量變化不大，微生物對淀粉的降解作用不明顯［12］。Numfor等［13］對發酵木薯粉和淀粉進行了研究，認為發酵過程的酸或酶水解支鏈淀粉使其形成類似直鏈淀粉的物質，使直鏈淀粉含量明顯升高。對強化發酵及自然發酵組樣品及制成的成品米粉測定淀粉、直鏈淀粉含量，結果見表2。

圖3 不同發酵組大米掃描電鏡照片（×500）

表2 不同發酵條件大米、米粉中淀粉、直鏈淀粉含量／g／100 g

第4、第5組浸泡米、成品米粉中的淀粉含量和直鏈淀粉含量顯著高于其他組（P＜0.05），第4組與第5組相比存在顯著差異（P＜0.05）。說明第4組接種L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14 及自然發酵組（第5組）微生物作用對于純化淀粉，提高淀粉含量改善米粉品質具有積極作用。本結果與閔偉紅［14］的研究結果基本一致，其研究表明采用乳酸菌發酵早秈米后直鏈淀粉含量有所增加。

2.5 發酵對大米顆粒表面微觀結構的影響

利用光學顯微鏡、掃描電子顯微鏡或偏光顯微鏡，可以從整體形態、顆粒大小、輪紋特點等方面對大米淀粉的微觀形貌進行研究。淀粉是大米中的主要成分，經過發酵后蛋白被分解，淀粉得到純化。對強化發酵及自然發酵組大米樣品進行掃描電鏡觀察，結果見圖3、圖4。

圖4 不同發酵組大米掃描電鏡照片（×2 500）

由圖3、圖4可見，各發酵組米粒表面結構被破壞嚴重，淀粉顆粒間出現了一定的孔隙，周圍形成了不連續、不規則的基質，結構非常疏松，形成了類似海綿的多孔狀結構。而未發酵米表面仍然較平整，未見疏松結構。說明發酵過程中產生的大量代謝產物、乳酸等對于大米表面結構有較大影響。同時可以看出，第3、第4組較第5組大米表面孔洞更多，形成層次錯落的結構（×2 500），結合pH變化情況，說明強化發酵加速了發酵過程。

2.6 強化發酵對米粉質構的影響

研究表明發酵后大米淀粉顆粒更加均勻，可形成均勻致密的凝膠，使發酵米粉的凝膠流變學特性發生明顯的改變［15］。對強化發酵及自然發酵組制得的米粉樣品進行質構特性測定，結果見表3。

表3 強化發酵對米粉質構的影響

第4、5組在硬度、彈性、黏聚性、膠著性、咀嚼性、回復性方面都顯著高于第1、2、3組的數值（P＜0.05）。說明第4 組接種L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14及自然發酵組（第5組）多種微生物作用可以提高米粉的硬度和彈性，改善米粉的咀嚼性和回復性。這可能是由于發酵產酸及產酶作用改變了淀粉的分子結構，支鏈淀粉分子發生斷鏈及脫支，使其水合能力增強，易于糊化，不易老化，利于保持凝膠水分，維持凝膠結構，而發酵使直鏈淀粉易于聚合和老化，形成較強的凝膠網絡［16］。這與直鏈淀粉含量增加相一致。

2.7 強化發酵對米粉感官品質的影響

感官評定對于評價食品的品質是很好的方法，雖然存在一定的缺陷，包括由評價人員情緒、喜好、品評環境帶來的一些不確定因素，但感官評定可以用來彌補儀器在爽滑感、筋道感、細膩感、色澤、氣味方面評價的不足。對強化發酵及自然發酵組制得的米粉樣品進行感官評價測定，結果見表4。

第4、第5組在硬度、凝聚性、彈性、爽滑感方面顯著高于第1、2、3 組的數值（P ＜0.05）；各組在細膩感、色澤、形態方面不存在顯著差異（P＞0.05）；自然發酵組（5組）在氣味方面與其他組存在顯著差異（P＜0.05），評分明顯低于其他各組；總評分上，除第1組數據明顯低于其他各組存在顯著差異，其他各組評分差異不明顯。綜合各組數值，第4組接種L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14 及自然發酵組（第5組）與第1、2、3組相比，經過多種微生物作用，在提高米粉品質，增加米粉彈性、爽滑感方面存在優勢。第4、第5組在氣味上存在差異，第5組米粉制品酸味明顯，另外在發酵過程中觀察發現發酵液產生大量氣泡，發酵液渾濁，這可能是腐敗微生物繁殖所致，而第4組米粉米香醇厚，發酵過程中無腐敗酸臭現象。綜合總評分，第4、5組評分最高，但不存在顯著差異，說明強化接種L-35+L-7+F-3+B-14發酵制得的米粉，在品質方面與自然發酵米粉不存在差異，而且在控制腐敗微生物、影響米粉氣味方面存在優勢。

3 結論

強化接種L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14微生物發酵的大米，在淀粉純化、降低蛋白質含量、提高直鏈淀粉含量等方面優于其他強化發酵組，但與自然發酵還是存在一定差異。經過對制得的米粉進行質構測定、感官評價測定，第4組與自然發酵組之間不存在顯著差異，但明顯優于其他強化發酵組。綜合各方面評分，第4組在優化大米結構、提高米粉品質方面存在明顯優勢，并結合pH、微生物量變化情況，強化發酵有利于加速發酵過程。因此強化接種L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14 微生物發酵得到的米粉品質良好，為今后開發米粉純種發酵劑提供了參考。

表4 強化發酵對米粉感官品質的影響

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Effect of Fortified Fermentation with Microorganisms on Quality of Rice Noodles

Li Yun Yang Mengyan Chen Xiaoxue Liang Jianfen Han Beizhong
（Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）

Fermented rice noodles were produced by inoculating Lactobacillus plantarum （L.p-35），Lactobacillus

fermentum （L.f-7），Candida tropicalis（C.t-3），and Bacillus subtilis（B.s-14）.The effect of fortified fermentation with microorganisms and traditional fermentation was compared on protein content，starch content，amylose content，textural properties and sensory quality by observing the effect if fermentation on the appearance structure of rice grain using the scanning electron microscope.The results indicated that compared with other fortified groups，the protein content of group 4 was decreased，and the starch content and amylose content were increased in fortified fermented rice noodles with 4 strains（L.p-35+L.f-7+C.t-3+B.s-14）.The analyses of scanning electron microscope showed that the structure of rice grain was eroded after fermentation.The textural qualities and sensory of group 4 and the natural fermented group on elasticity，smooth and smell were better than that of the others.Meanwhile the rice texture and rice noodles quality were improved.Fermentation process was promoted after fermentation fortified considering pH and microorganism changes.

rice noodles，fortified fermentation with microorganisms，lactic acid bacteria，quality

TS213.3

A

1003-0174（2016）11-0001-07

863計劃（2013AA102105），國家谷子糜子產業技術體系建設專項（CARS-07-12.5-A17）

2015-03-27

李蕓，女，1986年出生，博士，食品微生物學

韓北忠，男，1961年出生，教授，食品微生物學及發酵工程