整合素α3在髓母細胞瘤干細胞中的表達及對侵襲作用的影響

王勇+王玉社+陳航

【摘要】 目的 研究整合素α3在髓母細胞瘤干細胞中的表達及其對侵襲作用的影響。方法 應用免疫磁珠法（MACS）從髓母細胞瘤標本中獲得CD133+和CD133-細胞， 通過免疫組化和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測CD133+ 和CD133-兩組細胞中整合素α3的表達， 運用transwell細胞侵襲實驗觀察使用整合素α3抗體和未使用整合素抗體對CD133+侵襲作用的影響。結果 整合素α3在CD133+組的表達顯著高于CD133-組（P<0.01）；使用整合素α3單克隆抗體組穿膜細胞數目為（26.53±3.71）， 低于空白對照組的（54.76±6.27）（P<0.01）。結論 整合素α3在髓母細胞瘤干細胞的侵襲中起重要作用。

【關鍵詞】 髓母細胞瘤；干細胞；整合素α3；侵襲

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.30.013

【Abstract】 Objective To research expression of integrin α3 in medulloblastoma stem cells and its influence on invasion effect. Methods Magnetic activated cell sorting （MACS） was applied to taken CD133+ and CD133- cells from medulloblastoma samples. Immunohistochemistry and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （PCR） were used to detect expression of integrin α3 in CD133+ and CD133- cells. Influence by application of integrin α3 antibody on CD133+ invasion effect was observed by transwell cell invasion assay. Results Expression of integrin α3 in CD133+ group was obviously higher than that in CD133- group （P<0.01）. Monoclonal antibody had lower transmembrane cell number by integrin α3 as （26.53±3.71） than （54.76±6.27） in the blank control group （P<0.01）. Conclusion Integrin α3 shows important effect in invasion of medulloblastoma stem cells.

【Key words】 Medulloblastoma； Stem cells； Integrin α3； Invasion

髓母細胞瘤是兒童最常見的腦惡性腫瘤， 容易復發， 同時易沿蛛網膜下腔播散轉移。腫瘤細胞的侵襲性生長是一個多步驟的復雜過程， 有多種生物化學因子參與其中[1， 2]。本研究通過檢測髓母細胞瘤干細胞中整合素α3的表達， 同時應用抗整合素單克隆抗體， 觀察其對侵襲作用的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 髓母細胞瘤干細胞取自2013年～2015年河南省人民醫院神經外科手術標本。

1. 2 方法

1. 2. 1 髓母細胞瘤干細胞的培養和鑒定 腫瘤手術標本剪碎后胰蛋白酶消化， 吹打成單細胞懸液；過濾、離心收集細胞， 培養于神經干細胞培養液中（含Neurobasal培養基、1：50 B27添加劑、20 μg/L成纖維細胞生長因子、20 μg/L表皮細胞生長因子）， 在37℃、 5%CO2細胞培養箱中培養， 培養所得細胞呈神經球狀生長。

1. 2. 2 免疫磁珠法分選CD133+和CD133-細胞 使用免疫磁珠細胞分選試劑盒（Mihenyi Biotech公司）分離出CD133+和CD133-細胞， 并使用流式細胞分析儀進行純度測定。

1. 2. 3 逆轉錄定量PCR（QRT-PCR）檢測 QRT-PCR檢測分選后 CD133+細胞、CD133-細胞中整合素α3的表達， 上游引物5-GGAAGGAACAAAGACAGGCAAAC-3， 下游引物5-GGTA GTGGTGAGTGAGAAGTGGC-3。

1. 2. 4 免疫組化 本實驗采用免疫組化法， 整合素α3多克隆抗體購自武漢博士德公司， 工作濃度為1：100。

1. 2. 5 侵襲實驗 將CD133+細胞分為兩組進行侵襲實驗， 一組加入抗整合素α3單克隆抗體（購自武漢博士德公司）， 濃度為100 μg/ml；另一組為空白對照組。將Transwell小室加在24孔板上， 上室進行鋪膠， 每孔加入100 μl（每孔約含2×104 個細胞）無血清的細胞懸液， 下室加入500 μl含10% 胎牛血清的DMEM， 種板后置于培養箱培養24 h后， 取出上室， 棄掉上室中培養基， 多聚甲醛溶液固定， 結晶紫染色。倒置顯微鏡觀察， 拍照計數。

1. 3 觀察指標 觀察CD133+ 和CD133-兩組中整合素α3的表達、每個視野穿過小室聚碳酸酯膜的平均細胞數目。

1. 4 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 CD133+ 和CD133-兩組中整合素α3的表達 QRT-PCR 檢測結果顯示， CD133+ 和CD133-兩組中整合素α3mRNA相對表達量分別為（3.985±0.236）、（0.047±0.003）， 比較差異具有統計學意義（P<0.01）。免疫組化顯示CD133+組中整合素α3高表達， 而CD133-組低表達。另外， 整合素α3陽性的干細胞主要聚居在血管周圍。

2. 2 抗整合素單克隆抗體應用后對髓母細胞瘤干細胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實驗結果顯示， 使用整合素α3單克隆抗體組與空白對照組相比， 干細胞侵襲能力下降， 每個視野穿過小室聚碳酸酯膜的平均細胞數目顯著降低， 兩組的細胞數目分別為（26.53±3.71）、（54.76±6.27）， 比較差異有統計學意義（P<0.01）。

3 討論

近年來， 越來越多的證據支持腫瘤干細胞學說， 并認為腫瘤干細胞在腫瘤的發生、轉移、復發和對治療的抵抗中發揮著重要作用。干細胞特征的維持與干細胞所處的微環境（Niche， 壁龕）有密切關系。干細胞與基底膜的粘附是干細胞維持其特性的基本條件。干細胞通過各種粘附分子介導與細胞外基質之間的粘附， 從而使干細胞定居于壁龕中。整合素作為一類重要的細胞表面受體， 是重要的粘附分子之一。干細胞主要通過表達整合素實現對基底膜各種成分的粘附。干細胞對基底膜的脫粘附是誘導干細胞脫離干細胞群進入分化周期的重要調控機制。

整合素在多種惡性腫瘤中的表達明顯高于周圍的癌旁組織， 并且與預后明顯負相關， 說明它在腫瘤的侵襲轉移中起著重要作用。但關于其在干細胞中的表達報道較少。本研究通過免疫磁珠法分選出CD133+的干細胞和CD133-的細胞。然后應用免疫組化和QRT-PCR檢測兩組整合素α3的表達情況， 發現CD133+組明顯高于 CD133-組（P<0.01）。Lathia等[3]發現整合素不僅在CD133+的腫瘤干細胞中高表達；而且在Olig2+的腫瘤干細胞中同樣高表達。反過來， 他們收集整合素陽性的腫瘤干細胞， 培養后可以在更高頻率更短時間形成腫瘤。

神經干細胞一個重要特征是它們聚集在血管周圍的壁龕內。本研究證實了上述結論， 鏡下發現整合素陽性的干細胞主要聚居在血管周圍。Lathia等[3]還發現60%表達整合素α6的膠質母細胞瘤細胞位于血管5 μm以內。并且通過免疫組化雙染發現整合素和CD133+在血管周圍區域聯合表達。

正常情況下， 干細胞寄居在組織或器官特定的壁龕中， 破壞腫瘤干細胞居住的壁龕可以消滅腫瘤干細胞[4]。在本實驗應用抗整合素單克隆抗體使粘附于基底膜的腫瘤干細胞脫離， 從而破壞了干細胞的壁龕。通過Transwell實驗發現， 與對照組相比， 穿膜細胞數減少， 細胞的侵襲活動能力下降。

綜上所述， 整合素在髓母細胞瘤干細胞中的高表達， 以及通過抗整合素單克隆抗體破壞腫瘤干細胞的壁龕， 可使干細胞侵襲能力下降。整合素可作為將來治療髓母細胞瘤的一個方向。

參考文獻

[1] 王勇， 梁慶華， 史錫文. uPA和FAK在髓母細胞瘤中的表達及臨床意義.中國實用醫藥， 2012， 7（20）：40-42.

[2] 王勇， 毛伯鏞， 程宏偉， 等. uPA和KDR在髓母細胞瘤中的表達及意義.中華神經外科雜志， 2003， 19（2）：106-108.

[3] Lathia JD， Gallagher J， Heddleston JM， et al. Integrin alpha 6 regulates glioblastoma stem cells. Cell Stem Cell， 2010， 6（5）：421-432.

[4] Nakada M， Nambu E， Furuyama N， et al. Integrin α3 is overexpressed in glioma stem-like cells and promotes invasion. Br J Cancer， 2013， 108（12）：2516-2524.

[收稿日期：2016-10-25]