CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞檢測在創傷性肺損傷中的作用①

潘鴻錦，劉銀環，陳 輝，洪國粦

(福州市第二醫院胸外科， 福建 福州 350007)

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CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞檢測在創傷性肺損傷中的作用①

潘鴻錦，劉銀環，陳 輝，洪國粦

(福州市第二醫院胸外科， 福建 福州 350007)

目的：探究CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞動態監測在創傷性肺損傷中作用及臨床意義。方法：采用流式細胞術結合直接免疫熒光法檢測30例創傷性肺損傷患者外周血T細胞表面CXCR3和CD4+CD25+ CD127low調節性T細胞的表達水平。結果：創傷性肺損傷患者趨化因子受體CXCR3表達陽性率明顯高于正常對照組，分別為(35.72±3.49)%和(12.19±3.89)%(P<0.05)調節性T細胞(CD4+、CD25+ 、CD127low)陽性率明顯低于正常對照組，分別為(11.27±1.59)%和(13.75±1.72)%(P<0.05)。結論：CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞可參與創傷性肺損傷炎癥的發生和發展，有可能為疾病的預防和治療提供新思路和新途徑。

CXCR3；CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞；創傷性肺損傷

創傷性肺損傷是創傷患者中較常見的并發癥之一，以呼吸困難、 難治性低氧血癥和非心源性肺水腫為臨床特征。巨噬細胞、中性粒細胞等浸潤以及激活及血管內皮損傷是肺損傷的重要表現，而且肺損傷在分子水平表現上，主要體現在：眾多促炎因子、粘附分子以及趨化因子的表達水品過高，并且往往伴隨多種炎性介質(炎性級聯反應——因炎性介質產生，容易導致肺組織廣泛損傷)的產生。另外，肺損傷發病機制目前尚不明確，因此，探究CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞檢測在創傷性肺損傷中作用及臨床意義具有重要的現實價值。為此，本研究采用流式細胞儀檢測30例創傷性肺損傷外周血CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞表達的水平，探討CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞在創傷性肺損傷表達特點。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2013-11～2016-01門診和重癥ICU 30例創傷性肺損傷患者作為本次調查的研究對象， 30例健康體檢組。患者組30例中，男19例，女11例，年齡27～86歲，平均(49.7±3.5)歲；健康體檢組30例患者中，男18例，女12例，年齡26～85歲，平均(49.0±3.7)歲。本次調查研究的所有患者均符合創傷性肺損傷診斷標準(1992歐美聯席會議通過的診斷標準)，并且所有患者在臨床醫療之前，簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑：IgG1-FITC同型對照、IgG1-PE同型對照、IgG1- PC7同型對照、IgG1-ECD同型對照、CD3-PE、CXCR3-FITC、CD45-PC7、CD4- PE、 CD25-ECD、 CD127-PC7、FACS lysing solution等，本次調查研究所使用的試劑均由美國BD公司提供。

1.2.2 T直接免疫熒光標記法檢測淋巴細胞表面CXCR3水平。首先，選取2支試管，即試管1、試管2。然后，將100μL的全血放置于試管中，并且在試管1中添加10μL的IgG1-FITC、10μL的IgG1-PE以及10μL的CD45- PC7；在試管2中添加10μL的 CD3-PE、10μL的CXCR3-FITC以及10μL的CD45-PC7，將2支試管均室溫避光30min；隨后，在溫室避光后的2支試管中添加2mL 1×溶血素，再室溫避光10min，待溶血徹底完成之后，采取1000r/min離心5min，并且棄用上清，最后，利用2mL PBS洗滌2遍，并且重懸于0.5mL PBS中，進行最后的上機檢測。

1.2.3 T直接免疫熒光標記法檢測淋巴細胞表面CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞 。首先，選取2支試管，即試管1、試管2。然后，將100μL的全血放置于試管中，并且在試管1中添加10μL的 IgG1-ECD、10μL的IgG1-PE以及10μL的IgG1- PC7，在試管2中添加10μL的 CD4-PE、10μL的CD25- ECD以及10μL的CD127- PC7，將2支試管均室溫避光30min，其他操作與淋巴細胞表面CXCR3水平測試方法相同。

1.2.4 淋巴細胞群檢測分析(使用側向散射角(SSC)及CD45設門法)，確定檢測細胞數—10 000個，然后，利用CELLQuest軟件，對CD3+T淋巴細胞中CXCR3+細胞的百分率以及CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞的百分率進行計算分析。

1.3 統計學方法

2 結果

經檢測發現：CXCR3與創傷性肺損傷程度呈正相關關系，即：CXCR3表達水平越高，則創傷性肺損傷程度越重；CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞表達水平與創傷性肺損傷程度呈負相關關系，即：CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞表達水平越高，則創傷性肺損傷程度越輕。趨化因子受體CXCR3和調節性T細胞(CD4+CD25+CD127low)表達水平在創傷性肺損傷過度炎癥反應中具有重要作用；為臨床早期判斷創傷性肺損傷和預后觀察提供新指標，為臨床治療方案提供新的理論依據。兩組患者的CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low的陽性率。見表1。

表1 兩組的CXCR3和CD4+CD25+CD127low的陽性率

另外，CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞檢測結果見圖1～2。

圖1 CXCR3檢測結果

圖2 CD4+ CD25+ CD127low檢測結果

3 討論

創傷性肺損傷的發病機制錯綜復雜，涉及失控性炎癥反應、凝血/纖溶系統失衡、細胞凋亡、氧化應激、肺泡液體清除異常等多個層面。其中，眾多參與炎癥的細胞和細胞因子起著關鍵作用并成為目前肺損傷發病機制研究熱點，但缺少對肺損傷時免疫狀態改變及免疫調節的深入研究，因此，本課題組將利用流式細胞術檢測創傷性肺損傷患者外周血T細胞表面CXCR3和CD4+CD25+ CD127low調節性T細胞的表達水平，從而反映肺損傷時免疫狀態及免疫調節的改變特點，揭示他們在肺損傷發病機制中的作用，通過本研究或許能為臨床診斷和預后觀察提供免疫學的輔助指標。

趨化因子受體CXCR3是趨化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的共受體(由368個氨基酸組成)，臨床研究證實，趨化因子受體CXCR3屬于七次跨膜轉運G蛋白偶聯受體超家族之一，且主要分布在活化的Th1淋巴細胞上，其次分布在B細胞、NK細胞、內皮細胞上。多年的臨床研究表明：移植排斥反應、炎癥相關疾病的發生及發展與CXCR3水平具有密切的聯系[3]，而且本次調查研究的結果顯示：外周血T淋巴細胞CXCR3的表達水平與創傷并ALI呈正相關關系，且與健康對照組比較具有統計學意義， 這提示CXCR3與其配體結合趨化Th1淋巴細胞及炎癥細胞向肺部遷移、聚集，并產生局部免疫反應，造成肺部炎癥；CXCR3 的高表達能夠分泌出更多的炎癥介質TNF-α和IFN -γ(可能誘導更多的淋巴細胞集聚) ，繼而導致炎癥的維持、發展乃至蔓延，最終導致肺部失控性炎癥。

CD4+CD25+調節性 T 細胞本質上是一組T細胞亞群(具有免疫調節功能)，而且CD4+CD25+調節性 T 細胞除能夠真實的反映出CD4分子和 CD25 分子水平之外，其高表達能夠有效的轉錄因子Foxp3(Foxp3 已被證實是調節 T 細胞最可靠及特異的標志，CD127也可視為其可靠及特異的標志)[4]。另外，相關研究證實：CD127 表達水平與FOXP3 水平呈負相關關系[5]，因此， CD127 的低表達可視為其可靠及特異的標志，能夠代替FOXP3，以便檢測調節 T 細胞水平，并且CD127+CD4+CD25+CD127 能夠提升Treg 水平檢測的準確性。除此之外，CD127+CD4+CD25+CD127的顯著特征為無反應性和免疫抑制,因此，能夠在調控機體內環境穩定、維持自身免疫耐受等方面起到重要的推動作用。本研究顯示，創傷并ALI患者外周血中CD4+CD25+CD127low調節T細胞的表達明顯低于健康者，這充分的彰顯出：ALI時機體的免疫反應調節中調節T細胞發揮了重要作用，而且對免疫反應無抑制作用，因此，可能可能會加重炎癥反應，從而加劇肺損傷。

綜上所述，本實驗研究結果證明了CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調節性T細胞表達水平與創傷性肺損傷之間的相關性，也反映出：趨化因子受體CXCR3和調節性T細胞(CD4+CD25+CD127low)表達水平在創傷性肺損傷過度炎癥反應中具有重要作用。這與已有報道的動物實驗結果相似[6]。因此可以將檢測CXCR3和CD4+ CD25+ CD127low調節T細胞表達水平視為創傷性肺損傷病情診斷和觀察的輔助指標，此方面的研究可為今后治療、預后估計提供重要的實驗依據。鑒于本實驗研究參與調查的病例少，其結果只能是初步的觀察，因而還需要進一步更深入的研究。

[1]李慶.外周Th17/Treg失衡在動脈粥樣硬化中的作用及全反式維甲酸對其的影響和機制[J].安徽醫科大學,2010，25(9)：261-263

[2]石文波.聚乙二醇干擾素α-2a對慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+CD127low調節性T細胞及肝組織HBVcccDNA影響的研究[D].寧夏醫科大學,2014，23(11)：162-163

[3]孟醒初,朱志軍,蓋寶東. CXCR3在肝移植急性排斥反應中的表達[J]. 中國實驗診斷學, 2007,11(6):750-752

[4]Hori S， Nomura T， Sakaguchi S． Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3[J] ． Science， 2003，299:1057-1061

[5]Liu W， Putnam AL， Xu-Yu Z， et al． CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4 + T reg cells[J] ． J Exp Med， 2006，203: 1701-1711

[6]聶莉，吳 薇，魯志兵，等．CXCR3基因在小鼠急性肺損傷中的作用及與白細胞介素-10的關系[J]．武漢大學學報：醫學版，2016，37(2)：191-194

福州市衛生系統科技計劃項目，編號：2013-S-W5。

潘鴻錦(1965～)男，福建福州人，學士，主任醫師。

R563.8

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1008-0104(2016)06-0089-02

2016-05-10)