丹參素對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響

任清松，李瑞婷，夏良鋒，門茂元，杜偉達，欒海艷

(佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

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丹參素對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響

任清松，李瑞婷，夏良鋒，門茂元，杜偉達，欒海艷

(佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：研究丹參素對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響。方法：用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)腎小管上皮細胞，并將其分為A，B和C組。A 組被置于5.5mmol/L 低糖的DMEM 培養(yǎng)基中；B組和C 組則被置于25mmol/L高糖的DMEM 培養(yǎng)基中，與此同時C組加入0.2mg/mL丹參素進行藥物干預48h。實驗結(jié)束后，觀察腎小管上皮細胞的形態(tài)變化；免疫組織熒光技術(shù)檢測CK18、α-SMA 和Vimentin的蛋白表達。結(jié)果：①細胞形態(tài)變化：A組細胞呈多邊形或圓形，胞核也呈現(xiàn)橢圓形或圓形；B組的絕大多數(shù)細胞已失去原有形態(tài)，呈成纖維細胞樣的長梭形，且胞核也呈梭形變；C組的大部分細胞仍保持到原有的上皮細胞形態(tài)，僅少量呈成纖維細胞樣的長梭形改變。②CK-18、α-SMA和Vimentin 蛋白的表達：與N組相比，B 組的CK-18蛋白表達顯著下降(P<0.05)，α-SMA 和Vimentin的蛋白表達明顯升高(P<0.05)；而與H 組相比，C組的CK-18蛋白表達則明顯上升(P<0.05)，α-SMA 和Vimentin的蛋白表達則明顯下降(P<0.05)，但與N 組相比，仍有明顯差異(P<0.05)，未達到正常水平。結(jié)論：丹參素能通過升高CK-18和降低α-SMA、Vimentin 的蛋白表達來抑制高糖環(huán)境對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的誘導作用。

丹參素；腎小管上皮細胞；轉(zhuǎn)分化

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN) 是最常見的糖尿病慢性并發(fā)癥，是由長期高血糖所引起的慢性進展性腎臟疾病，也是糖尿病患者最常見的器官并發(fā)癥之一，其腎功能的下降程度與腎小管及其間質(zhì)纖維化的關(guān)系極其密切。尤其是近些年來，隨著糖尿病腎病發(fā)生率的逐年上升，導致腎臟慢性疾病(Chronic renal disease，CRD) 的患病率也逐年提高，業(yè)已成為致使糖尿病患者死亡率升高的主要誘因之一，但其發(fā)病機制至目前為止仍未完全明了。故而明確糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展機制，對預防或延緩其發(fā)病有著十分重要的臨床醫(yī)學價值和社會意義。本研究項目擬采用使腎小管上皮細胞處于高糖環(huán)境，由高糖誘導使其發(fā)生轉(zhuǎn)分化，然后給予中藥丹參素(danshensu, DSS) 進行藥物干預，觀察其對高糖環(huán)境誘導的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響，以期為臨床應用丹參素治療糖尿病腎病提供充分的理論和實驗依據(jù)，為臨床治療糖尿病腎病提供一個新的治療途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞

人腎近曲小管上皮細胞(HK-2) 購于上海信裕生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

丹參素(購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，藥物純度：98.0 %)；DMEM 培養(yǎng)基(購于Hyclone, USA)；胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, 購于Gibco, USA)；α-SMA(購于上海亞培生物科技有限公司)；CK-18、Vimentin(購于武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗對象及分組

用含10 % 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)腎小管上皮細胞于37℃，5 % CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。待細胞生長達到融合狀態(tài)(即鋪滿瓶壁80%～90%以上)時，采用0.05%胰蛋白酶溶液進行消化，按1:3～1:6密度接種傳代，并取處于對數(shù)生長期細胞時用于后續(xù)實驗研究。

實驗共分3組：正常糖對照組(A組)；高糖對照組(B組)；丹參素組(C組)。

1.2.2 給藥方案

正常糖對照組被置于5.5mmol/L低糖的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；高糖對照組和丹參素組均被置于25mmol/L高糖的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)；但丹參素組同時加入丹參素(0.2mg/mL) 進行藥物干預48h。

1.2.3 檢測指標

于倒置顯微鏡下觀察腎小管上皮細胞的形態(tài)學改變情況；免疫組織熒光技術(shù)檢測CK-18、α-SMA 和Vimentin 的蛋白表達情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件處理分析，所有數(shù)據(jù)均以表示；組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腎小管上皮細胞的形態(tài)學變化

正常糖對照組：細胞呈多邊形或圓形，胞核也呈現(xiàn)橢圓形或圓形；高糖對照組：絕大多數(shù)細胞已失去原有形態(tài)，呈現(xiàn)成纖維細胞樣的長梭形，且胞核也呈梭形變；丹參素組：大部分細胞仍保持到原有的上皮細胞形態(tài)，僅少量細胞呈現(xiàn)成纖維細胞樣的長梭形改變。

2.2 CK-18、α-SMA和Vimentin的表達

與正常糖對照組相比，高糖對照組細胞的CK-18蛋白表達顯著降低(P<0.05)；而與高糖對照組相比，丹參素組則明顯上升(P<0.05)，但與正常糖對照組相比，仍有明顯差異(P<0.05)。見表1。

與正常糖對照組相比，高糖對照組的α-SMA、Vimentin蛋白表達明顯升高(P<0.05)；而與高糖對照組相比，丹參素組則明顯降低(P<0.05)，但與正常糖對照組相比，仍未達到正常水平(P<0.05)。見表1。

表1 CK-18、α-SMA和Vimentin在各組中的表達(陽性細胞比率，

A組vs B組，*P <0.05；A組vs C組，#P <0.05。

3 討論

研究表明，無論從發(fā)病時間或機制來說，腎小管結(jié)構(gòu)或功能的改變對糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展均具有十分重要的作用。腎小管間質(zhì)病變的嚴重程度與糖尿病腎病的腎功能損害密切相關(guān)，是反映腎功能下降嚴重程度和判斷預后最重要的指標。腎小管及其間質(zhì)纖維化的發(fā)生機制主要是細胞外基質(zhì)(extracelluar matrix, ECM) 的分泌與降解失衡，此外還有成纖維細胞的增生，以及腎小管的萎縮和消失[1]，其中ECM的增多更是直接導致了腎纖維化的進行性發(fā)展。肌成纖維細胞是腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生過程中產(chǎn)生ECM的主要細胞，但正常腎組織中幾乎沒有肌成纖維細胞，大量的研究表明腎小管上皮細胞在病理條件下則可發(fā)生轉(zhuǎn)分化成為肌成纖維細胞，喪失了上皮細胞黏附特性，即表皮黏附分子—E-cadherin 的表達減少；而α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin) 等間充質(zhì)細胞表型蛋白表達增多[2,3]。

丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.) 是藥理活性廣泛、高效、低毒的化合物，能夠拮抗動脈粥樣硬化，改善由缺血缺氧所引起的細胞代謝障礙，改善微循環(huán)障礙，保護心肌細胞[4]，保護神經(jīng)細胞[5]，增強機體免疫力，保護肝臟細胞及防治肝臟的纖維化[6]。此外，丹參在對腎結(jié)構(gòu)和功能也有十分顯著的影響，能清除腎組織中的氧自由基，進而保護腎血管內(nèi)皮細胞；通過降低血黏稠度，抑制血小板聚集，來改善腎臟的血液微循環(huán)；增加SOD 的表達活性，降低空腹血糖和糖化血紅蛋白的水平，抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化，內(nèi)源性膽固醇(Ch)、Ⅳ型膠原和血漿內(nèi)皮素的合成[7]，最終改善糖尿病腎病的糖脂代謝紊亂[8]。丹參注射液還能下調(diào)大鼠腎皮質(zhì)層黏連蛋白和Ⅳ型膠原的表達水平，改善由阿霉素所致的腎小球硬化；降低腎梗阻手術(shù)后梗阻側(cè)大鼠腎臟α-SMA 和TGF-β1 的表達水平，并減少Ⅰ型膠原蛋白的沉積，延緩腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。雖然丹參對糖尿病腎病和腎纖維化有一定的療效，但作為一種組成成分復雜的傳統(tǒng)中藥，對其發(fā)揮防治作用的最佳活性成分和具體作用機制的研究并不十分清楚和透徹，這就造成了丹參的使用效率不高和藥物副作用較大的弊端。因此，本研究著重選取了丹參主要的水溶性成分—丹參素作為我們的研究對象。我們的研究發(fā)現(xiàn)丹參素具有抑制高糖環(huán)境對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的誘導作用，減少腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化成為成纖維細胞的比率，維持腎小管上皮細胞的正常形態(tài)。與糖尿病模型組相比，丹參素組腎小管上皮細胞當中的CK-18 蛋白表達升高，而Vimentin、α-SMA 的蛋白表達降低，所以丹參素對高糖環(huán)境對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化誘導的抑制作用可能是通過抑制上皮細胞的特異蛋白CK-18 表達的降低和Vimentin、α-SMA 的蛋白升高來實現(xiàn)的。這不但為丹參防治糖尿病腎病提供了更有力的理論依據(jù)，也提高了其利用效率，并降低其副作用，更好的發(fā)揮了祖國傳統(tǒng)醫(yī)學的作用。

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佳木斯大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目，編號：2014xj03。

任清松(1991～)男，黑龍江佳木斯人，學士。

欒海艷(1979～)女，黑龍江佳木斯人，博士，講師，碩士研究生導師。E-mail:luanhaiyan@jmsu.edu.cn。

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