Vinculin和GFAP在大鼠肝纖維化中纖維母細(xì)胞的表達(dá)

張 輝,劉東璞,李 堯，王景霞，王淑英

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

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Vinculin和GFAP在大鼠肝纖維化中纖維母細(xì)胞的表達(dá)

張 輝,劉東璞,李 堯，王景霞，王淑英

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

目的:肝臟內(nèi)有兩種纖維母細(xì)胞,一種稱(chēng)之為肝星形細(xì)胞(hepatic stellate cell HSC),另一種是位于門(mén)脈周?chē)睦w維母細(xì)胞。對(duì)這兩種細(xì)胞在形成肝纖維化(hepatic fibrosis HF)后的細(xì)胞形態(tài)采用免疫組化方法進(jìn)行組織學(xué)鑒別。方法: Wistar大鼠48只，雄性，體質(zhì)量(160～210)g。隨機(jī)選取24只,分為4組，每組6只，使用30% CCl4/mineral oil(1mL/kg)行腹腔內(nèi)注射,并且分別于注射1d，2d，3d，4d后麻醉處死，取新鮮肝臟。其余24只,同樣隨機(jī)分為4組，每組6只 ,分別行膽總管結(jié)扎術(shù)1d,2d,4d,7d后麻醉處死，取新鮮肝臟。用SABC法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，一抗分別為Vinculin及GFAP。結(jié)果:CCl4腹腔注射后2d中央靜脈周?chē)腍SCs在Vinculin和GFAP染色中呈相同的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá); BDL處置4d后門(mén)脈區(qū)纖維母細(xì)胞在Vinculin染色中顯示陽(yáng)性結(jié)果,而在GFAP染色中呈現(xiàn)陰性結(jié)果。結(jié)論: Vinculin在HSCs和門(mén)脈區(qū)域的纖維母細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果相同, GFAP可對(duì)有活性的HSCs和門(mén)脈區(qū)域的纖維母細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)鑒別。

肝星形細(xì)胞;肝纖維化;CCl4;BDL; Vinculin;GFAP

肝纖維化是繼發(fā)于肝臟各種慢性損傷之后進(jìn)行組織修復(fù)過(guò)程中的創(chuàng)傷愈合反應(yīng),而且它也是形成肝硬化所必經(jīng)的病理過(guò)程。經(jīng)研究顯示,HSCs的激活與增生在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了極其重要的作用[1]。并且經(jīng)研究表明,HSCs在肝纖維化過(guò)程中屬于關(guān)鍵介導(dǎo)環(huán)節(jié)。用四氯化碳誘導(dǎo)的方法來(lái)制作Wistar大鼠急性肝損害模型,能夠?qū)е虏⒂^察到細(xì)胞外基質(zhì)的形態(tài)變化[2]。而且根據(jù)相關(guān)報(bào)道顯示，用膽總管結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)的方法來(lái)制作Wistar大鼠急性肝損害模型,使門(mén)脈周?chē)睦w維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞[3]。在對(duì)這兩種細(xì)胞群進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn), HSC的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的脂滴內(nèi)含有維生素A,而在門(mén)脈周?chē)睦w維母細(xì)胞內(nèi)卻沒(méi)有觀察到,因此在形態(tài)學(xué)上可以利用此特點(diǎn)對(duì)二者進(jìn)行分析鑒別,但是在形成肝纖維化后，從形態(tài)學(xué)角度上已經(jīng)不能區(qū)分這兩類(lèi)細(xì)胞群。本研究首先用兩種方法制作大鼠急性肝損害模型,而后采用免疫組化方法對(duì)HSC和門(mén)脈周?chē)募±w維母細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)和觀察。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠,體質(zhì)量(160～210)g。由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Vinculin單抗、GFAP單抗、SABC試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝纖維化動(dòng)物模型的制作

Wistar大鼠48只，雄性，體質(zhì)量(160～210)g。隨機(jī)選取24只,分為4組，每組6只，使用30% CCl4/mineral oil(1mL/kg)行腹腔內(nèi)注射,并且分別于注射1d，2d，3d，4d后麻醉處死，取新鮮肝臟。其余24只,同樣隨機(jī)分為4組，每組6只 ,分別行膽總管結(jié)扎術(shù)1d,2d,4d,7d后麻醉處死，取新鮮肝臟。

1.2.2 肝組織病理學(xué)觀察及免疫組化染色

摘除的肝臟進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,常規(guī)HE染色后進(jìn)行病理學(xué)觀察肝纖維化程度。而后,運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行染色,所用一抗為Vinculin和GFAP。其染色結(jié)果由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專(zhuān)家觀察并評(píng)估各組染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 GFAP免疫組化結(jié)果

在CCl4注射后所形成的大鼠急性肝損害模型中，注射2d后，對(duì)中心靜脈周?chē)腍SC進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)GFAP 強(qiáng)陽(yáng)性染色(圖1)。在對(duì)BDL方法所形成的大鼠肝纖維化模型的觀察中，在對(duì)肝實(shí)質(zhì)周邊以及位于膽小管增生區(qū)域的HSCs進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)， GFAP表達(dá)呈現(xiàn)弱陽(yáng)性，而在對(duì)門(mén)脈區(qū)域內(nèi)的纖維母細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其 GFAP呈現(xiàn) 陰性表達(dá)(圖2)。

圖1 GFAP在CCl4注射2d后的表達(dá)(×400)

圖2 GFAP在BDL處置2d后的表達(dá)(×400)

圖3 Vinculin在CCl4注射1d后的表達(dá)(×400)

圖5 Vinculin在CCl4注射3d后的表達(dá)(×400)

圖6 Vinculin在BDL處置2d后的表達(dá)(×400)

圖7 Vinculin在BDL處置4d后的表達(dá)(×400)

2.2 Vinculin免疫組化結(jié)果

在CCl4注射后所形成的大鼠急性肝損害模型中，注射一天后，發(fā)現(xiàn)HSCs的表達(dá)呈現(xiàn)弱陽(yáng)性(圖3)；而注射2d后，對(duì)中央靜脈附近區(qū)域的HSC進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)Vinculin強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖4)；而在

注射3d后，對(duì)肝實(shí)質(zhì)內(nèi)的HSCs進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其Vinculin表達(dá)呈現(xiàn)弱陽(yáng)性(圖5)。而在對(duì)BDL方法所形成的大鼠肝纖維化模型的觀察中，并且在BDL 2d(圖6)及4d(圖7)后，對(duì)門(mén)脈區(qū)域內(nèi)已活化的纖維母細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)Vinculin陽(yáng)性表達(dá)。

3 討論

肝纖維化是由多方因素協(xié)同作用所導(dǎo)致的慢性肝損害病理改變，其主要表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)成分的沉積量有所失衡[4]，而且可以對(duì)肝的正常功能有所損害，在各種臨床慢性肝病發(fā)展為肝硬化的過(guò)程中，肝纖維化屬于其所必經(jīng)的階段。本研究利用CCl4腹腔注射及BDL兩種實(shí)驗(yàn)方法制作急性大鼠肝損害模型，并制備病理切片標(biāo)本，使用免疫組化方法對(duì)Vinculin和GFAP在大鼠肝纖維化中纖維母細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

經(jīng)病理組織學(xué)切片觀察顯示，在CCl4肝纖維化模型組中，腹腔注射2d后，對(duì)中心靜脈周?chē)腍SCs進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)GFAP 強(qiáng)陽(yáng)性染色；而對(duì)中央靜脈附近區(qū)域的HSCs進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)Vinculin同樣呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。而在BDL大鼠肝纖維化模型中，在行BDL術(shù)4d 后，對(duì)門(mén)脈區(qū)域內(nèi)的纖維母細(xì)胞進(jìn)行觀察，未發(fā)現(xiàn)GFAP有陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，呈現(xiàn)GFAP陰性。在對(duì)門(mén)脈纖維母細(xì)胞的觀察中發(fā)現(xiàn)，并且對(duì)門(mén)脈以及增生的膽小管上皮細(xì)胞間隙中進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)門(mén)脈纖維母細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為MF。同時(shí)對(duì)門(mén)脈區(qū)域和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，在其間發(fā)現(xiàn)有已經(jīng)活化的HSCs，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)Vinculin陽(yáng)性表達(dá)，從此可以證明Vinculin抗體可以成為門(mén)脈區(qū)域纖維母細(xì)胞被活化的一種標(biāo)記。

CCl4肝纖維化模型以及BDL肝纖維化模型，這兩種實(shí)驗(yàn)方法雖然有所不同，但在處置并形成肝纖維化后，對(duì)HSCs和門(mén)脈區(qū)域纖維母細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色并進(jìn)行比較觀察，發(fā)現(xiàn)Vinculin染色均呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，而GFAP染色表達(dá)卻有所差別。由此可知，對(duì)成功的肝纖維化模型制作常規(guī)病理石蠟切片標(biāo)本，在對(duì)有活性的HSCs和門(mén)脈纖維母細(xì)胞之間進(jìn)行鑒別分析，GFAP抗體可以作為檢測(cè)這兩種纖維母細(xì)胞的一個(gè)指標(biāo)。

[1]Fowell AJ, Collins JE, Duncombe DR, et al. Silencing tissue inhibitors of metalloproteinases(TIMPs) with short interfering RNA reveals a role for TIMP-1 in hepatic stellate cell proliferation[J].Biochem biophys Res commun, 2011,407(2):277-282

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[3]Desmouliere A,Darby I,Costa AMA,et al.Extracellular matrix deposition, lysyl oxidation expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat[J].Lab Invest,1997,76:765-778

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1.黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題,編號(hào):2011-428；2.佳木斯大學(xué)指導(dǎo)項(xiàng)目，編號(hào)：S2009-074。

張輝(1976～)男,黑龍江佳木斯人,碩士,副教授。

劉東璞(1969～)男，黑龍江佳木斯人，碩士,副教授,碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:liudongpu1220@163.com。

R575.2

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1008-0104(2016)06-0022-02

2016-07-11)