枯草芽胞桿菌谷氨酰胺轉氨酶在谷氨酸棒桿菌中的分泌表達及誘導條件的優化

黃 琳，劉逸寒，李明杰，李 瑞，郭 偉，桂 爽，路福平

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

枯草芽胞桿菌谷氨酰胺轉氨酶在谷氨酸棒桿菌中的分泌表達及誘導條件的優化

黃 琳，劉逸寒，李明杰，李 瑞，郭 偉，桂 爽，路福平

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，工業酶國家工程實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

本文通過重疊PCR技術構建獲得枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)來源的谷氨酰胺轉氨酶(transglutaminase，TG)(BTG)重組基因Sprodbtg，該基因依次包含SD序列、谷氨酸棒桿菌信號肽ΔS0949序列、proD-BTG基因，并將該目的基因克隆入大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達載體pXMJ19中構建重組質粒pXMJ19-Sprodbtg．隨后，重組質粒電轉入谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中進行誘導表達，并對重組菌株的誘導條件進行優化．結果表明：重組菌株C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg表達重組酶原蛋白proD-BTG經活化后，BTG的活力達到(41.23±2.01)U/L；在重組菌培養12 h后誘導、IPTG終濃度0.8 mmol/L、誘導40 h的最優誘導條件下，BTG的活力達到最高，為(55.62±2.34)U/L，較優化前提高了約 34.90%,．

谷氨酰胺轉氨酶；谷氨酸棒桿菌；枯草芽胞桿菌；分泌表達；條件優化

谷氨酰胺轉氨酶(transglutaminase，TG)是一種催化酰基轉移反應的轉移酶，催化蛋白質分子內和分子間發生交聯、蛋白質和氨基酸之間的連接以及蛋白質分子內谷氨酰胺基的水解反應[1]．由于其安全、特有的交聯性質，可用于改善蛋白質的結構和功能性質，在植物蛋白制品、焙烤制品、魚、肉、乳類制品、固定化酶、可食性包裝等行業已有廣泛應用[2-6]．

目前，僅茂源鏈霉菌(Streptomyces mobaraense)谷氨酰胺轉氨酶(MTG)實現了商業化生產，但茂源鏈霉菌生長慢、發酵周期長、酶活力收率低[7]，造成MTG價格較高；另外，隨著食品加工業種類逐漸增多，MTG的特性無法滿足一些食品加工底物和過程的需求，因此，亟需開發不同特性的TG．枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)谷氨酰胺轉氨酶(BTG)是在1996年被Kobayashi等[8]首次發現，且經驗證BTG的分子結構沒有信號肽和前肽；Suzuki等[9]發現BTG最適作用pH為8.2，最適作用溫度為60 ℃，可催化酪素液及BSA蛋白分子的凝膠化和交聯；并且，經分析BTG和MTG在氨基酸序列和空間結構上有很大區別，這為開發新型TG奠定了基礎．

本研究室在前期研究中從枯草芽胞桿菌(B. subtilis)168ATCC23857基因組克隆了BTG基因，該基因僅編碼成熟肽，對異源宿主細胞有毒性[10]，影響其正常生長，難以實現BTG高效表達．研究發現，來自于生暗灰鏈霉菌(S．caniferus)的TG前肽proD對BTG活性的抑制率最高，達到70%[11]．然而，大腸桿菌表達系統難以實現proD-BTG酶原的高效表達．谷氨酸棒狀桿菌蛋白分泌機制健全，生長迅速，培養簡便，使用安全，無致病性，是表達外源基因的良好受體菌，本研究室已利用谷氨酸棒桿菌表達系統實現了BTG的異源表達[12]．因此，基于上述研究，本文以谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032為宿主菌株，構建重組菌株C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg以實現proD-BTG的高效分泌表達，并對其誘導條件進行優化，旨在為BTG的研究奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌(Escherichia coli)JM109、谷氨酸棒狀桿菌(C．glutamicum)ATCC13032、大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達質粒pXMJ19和克隆有prodbtg基因的質粒pET28a-prodbtg均為本實驗室保藏．

1.1.2 酶與主要試劑

限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ、T4 DNA連接酶、Probest高保真酶，TaKaRa公司；溶菌酶、RNase，上海生工生物工程有限公司；小量瓊脂糖凝膠DNA試劑盒、PCR產物純化回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒，北京莊盟國際生物基因科技有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒，碧云天生物技術研究所；蛋白胨和酵母浸粉，Oxoid公司；Factor Xa，Sigma公司；其他試劑均為國產分析純．

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 5，pH 7.0．

LA培養基：LB+2%,瓊脂粉，pH 7.0～7.2．

谷氨酸棒桿菌復蘇培養基：LB+0.5%,葡萄糖，pH 7.0～7.2．

谷氨酸棒桿菌產MTG培養基(MMTG)(g/L)：葡萄糖60，MgSO41，(NH4)2SO430，KH2PO41.5，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，鹽酸硫胺素4.5×10-4，生物素4.5×10-4，甲硫氨酸0.15，CaCO350，pH 7.5．

1.1.4 引物設計

為了使得外源蛋白在谷氨酸棒狀桿菌中實現高效分泌表達，設計含SD序列及C．glutamicum R來源的有高效分泌能力信號肽ΔS0949序列[13]的重組proD-BTG基因序列．依據引物設計原則[12]設計引物. 上游引物P1：5′-TATCGGCGCTGCCAGCATGT TTATGCCAAAGGCCAACGCCCAAGGAGCACTCG AGGCCAGCGGCGGC-3′；P2：5′-CCCAAGCTT AAA GGAGGACACGCATGCAAATAAACCGCCGAGGCT TCTTAAAAGCCACCGCAGGACTTGCCACTATCG GCGCTGCCAGCATG-3′；下游引物R1：5′-CGCGG ATCC TTAGCGGACGATGCGG-3′．上游引物P1 5′端不含有酶切位點；上游引物P2 5′端含有HindⅢ酶切位點(AAGCTT)；下游引物R1 5′端含有BamHⅠ酶切位點(GGATCC)．

1.2 方法

1.2.1 Sprodbtg基因的擴增

通過重疊PCR將SD序列和信號肽ΔS0949序列克隆于proD-BTG基因的N端，獲得目的基因．第1輪PCR以質粒pET28a-prodbtg為模板，以P1、R1為引物擴增目的基因；第2輪PCR以第1輪擴增產物為模板，以P2、R1為引物擴增出最終目的基因含SD序列及ΔS0949 全長序列的proD-BTG基因．PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72 ℃10 min．

1.2.2 重組質粒pXMJ19-Sprodbtg的構建

經切膠、回收、純化后的PCR產物(Sprodbtg基因)及pXMJ19質粒均用HindⅢ和BamHⅠ進行雙酶切，分別回收酶切產物，經純化后，用T4 DNA連接酶于16,℃連接過夜并轉化至E．coli JM109，然后涂布于含50 μg/mL氯霉素的平板，挑取轉化子，提取質粒，酶切驗證．將驗證正確的重組質粒命名為pXMJ19-Sprodbtg．

1.2.3 重組菌株C．glutamicum ATCC13032/pXMJ 19-Sprodbtg的構建

取6 μL 構建好的質粒pXMJ19-Sprodbtg電轉化至C．glutamicum ATCC13032感受態細胞，電擊條件同挑取轉化子酶切驗證，將驗證正確的重組菌株命名為C．glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg．質粒pXMJ19轉化子C．glutamicum ATCC13032/ pXMJ19作為對照菌株．

1.2.4 重組菌C. glutamicumATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg及C. glutamicumATCC13032/pXMJ 19的誘導表達

分別挑取1環重組菌C．glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-Sprodbtg或C．glutamicum ATCC 13032/pXMJ19單菌落，分別接種于裝有50,mL LB培養基的250,mL三角瓶中，30 ℃、200,r/min振蕩培養過夜，以1%,的接種量分別轉接于裝有100 mL MMTG的500 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養12,h，加入終濃度為1,mmol/L的IPTG誘導酶原蛋白proD-BTG的表達，繼續培養48 h．分別取1 mL重組菌發酵液于12,000,r/min離心1,min，獲取上清液，向其中分別加入130 μL 100%, TCA，冰上放置30 min，12,000,r/min離心5,min，棄去上清液，加1,mL丙酮洗滌2次．待丙酮揮發完全后，沉淀分別溶解于20,μL無菌蒸餾水中，各加入5,μL 5×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，沸水浴5,min，12,000,r/min離心10,min，分別取上清液進行SDS-PAGE分析．

1.2.5 酶原蛋白proD-BTG的酶活力測定[15]

含有酶原蛋白proD-BTG的發酵液通過4,000,r/min離心15,min回收上清液，一定量的Factor Xa加入到表達proD-BTG的重組谷氨酸棒桿菌上清液中切割重組蛋白．隨后通過熒光定量分析法分析酶原蛋白proD-BTG的酶活力．

酶活力檢測反應體系：90,μL(5,mg/mL)的重組酶和1.98,mL 50,mmol/L Tris-HCl(pH,7.5)包括0.2%, N，N-二甲基酪蛋白，12.5,μmol/L 丹磺尸胺(MDC)，4.5,mmol/L DTT．反應體系于37,℃反應30,min，加入42,mmol/L(NH4)2SO4終止反應，于激發波長350,nm下檢測發射波長500,nm下的熒光強度．

酶活力定義：每分鐘催化1 nmol/L的MDC插入到N，N-二甲基酪蛋白所需的酶量定義為1個活力單位(U)．

1.2.6 重組菌C．glutamicumATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg誘導條件的優化

重組菌生長曲線的繪制：將培養過夜的菌液按1%,的接種量接入50,mL含有10,μg/mL氯霉素的MMTG培養中，30 ℃、200 r/min振蕩培養，間隔一定時間取樣，以MMTG培養基為空白對照，檢測培養液600,nm下的吸光度．以該菌種培養時間為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制生長曲線．

最佳誘導時機的確定：分別在接種4、8、12、16、20,h后加入終濃度為1,mmol/L的IPTG開始誘導，30,℃誘導48,h，檢測分析誘導時機對proD-BTG表達量的影響．

最佳誘導時間的確定：在最佳誘導時機加入終濃度為1 mmol/L的IPTG開始誘導，30,℃誘導20、30、40、50、60 h，檢測分析誘導時機對proD-BTG表達量的變化．

IPTG最佳誘導濃度的確定：在最佳誘導時機加入終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2,mmol/L的IPTG開始誘導，30,℃誘導至最佳時間，分析IPTG濃度對proD-BTG表達的影響．

2 結果與分析

2.1 Sprodbtg基因的擴增

本實驗室前期構建的質粒pET28a-prodbtg中目的基因未發生突變，以該質粒作為模板，分別用引物P1、R1和P2、R1擴增基因Sprodbtg．PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得約為1,100,bp的目的片段(圖1)，其大小與Sprodbtg預計大小相符，表明Sprodbtg擴增成功．該基因上游外源加入了一段SD序列及C．glutamicum高效分泌蛋白的信號肽序列ΔS0949，使得prodbtg具有了在C．glutamicum中分泌表達的潛力．

2.2 重組質粒pXMJ19-Sprodbtg的構建

將PCR產物切膠回收后用限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ進行雙酶切，后與同樣經過HindⅢ和BamHⅠ雙酶切的質粒 pXMJ19連接，然后轉化至E．coli JM109，涂布含氯霉素質量濃度為50,μg/mL的平板．經篩選挑取陽性菌落活化后提取質粒，用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切驗證，同時將pXMJ19 空質粒用 HindⅢ進行單酶切作為對照，結果如圖2所示．空質粒經HindⅢ單酶切獲得約6,600,bp的片段，重組質粒經HindⅢ和BamHⅠ雙酶切獲得約6,600,bp和1,100,bp的兩條帶，其中大片段與空質粒pXMJ19大小(6,600,bp)相符，小片段與目的基因Sprodbtg大小相符，表明Sprodbtg基因已成功連接到表達載體上．

圖1 Sprodbtg PCR擴增產物電泳圖Fig. 1 Identification of Sprodbtg

圖2 質粒pXMJ19-Sprodbtg酶切驗證Fig. 2 Recombined plasmids pXMJ19-Sprodbtg digested by restricted endonuclease

2.3 谷氨酸棒桿菌的電轉化及鑒定

提取重組質粒pXMJ19-Sprodbtg并電擊轉化谷氨酸棒桿菌感受態細胞，以空質粒pXMJ19作為對照菌株．涂布于含氯霉素10,μg/mL的LA抗性平板，挑取轉化子酶切驗證．

2.4 重組菌的誘導表達

按照1.2.4方法對轉化子進行誘導表達，將誘導48,h后的重組菌株C．glutamicum ATCC13032/ pXMJ19-Sprodbtg和對照菌株C．glutamicum ATCC13032/pXMJ19 發酵液經TCA沉淀濃縮后進行SDS-PAGE分析，結果如圖3所示．

圖3重組谷氨酸棒桿菌發酵上清液 SDS-PAGE 分析Fig. 3SDS-PAGE analysis of supernatant of C. glutamicum of the recombined strains

泳道1陽性轉化子C. glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-Sprodbtg在大約3.8×104處出現1條特異性蛋白條帶，其大小與預測的proD-BTG的相對分子質量一致．泳道2中對照菌C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19未見相應目的蛋白條帶，從而初步說明proD-BTG在谷氨酸棒桿菌中被成功分泌表達．

2.5 酶原蛋白proD-BTG的酶活力測定

重組菌C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg表達酶原蛋白 proD-BTG 經Factor Xa切割后，熒光法測定酶活力，結果顯示BTG活力為(41.23±2.01)U/L．

2.6 重組菌C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg誘導條件優化

2.6.1 生長曲線的繪制

重組菌在氯霉素濃度為10 μg/mL的MMTG培養基中的生長曲線如圖4所示．由圖4可知：重組菌株4,h后進入對數生長期，14,h后生長減緩，18 h后進入穩定期．

2.6.2 誘導時機對目的蛋白proD-BTG表達的影響

取不同誘導時機的發酵液添加Factor Xa并測定重組菌BTG的活力，結果如圖5所示．在培養4 h后進行誘導，目的蛋白在重組菌中表達量非常低；然后隨著菌體密度的增大而進行誘導，目的蛋白的表達量也隨之增加．在培養12 h(A600約為2.2)時進行誘導達到最高酶活力(47.43±2.34)U/L，此時為重組菌對數生長期的中后期，目的蛋白的表達量基本達到最大，之后表達量開始下降，這可能是后期培養基中的營養被大量消耗，缺乏充足的營養用于目的蛋白的合成，因此當培養12,h后開始誘導，為最適的誘導時機.

圖4 C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg生長曲線Fig. 4 Growth curve of C. glutamicum ATCC13032/ pXMJ19-Sprodbtg

圖5 不同誘導時機對proD-BTG蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of different inducing period on protein proD-BTG expression

2.6.3 誘導時間對目的蛋白proD-BTG表達的影響

如圖6所示，當誘導時間為10～40 h時，目的蛋白的表達量隨著誘導時間的增加而增加，最高達到(54.69±3.35)U/L；而當誘導時間超過40 h后，表達量有所下降，推測可能由于菌體開始進入衰亡期，裂解的菌體釋放出的蛋白酶降解了部分重組蛋白，導致重組蛋白表達量的下降．所以最佳誘導時間定為40 h．

圖6 不同誘導時間對proD-BTG蛋白表達的影響Fig. 6 Effect of induction time on protein proD-BTG expression

2.6.4 IPTG濃度對目標蛋白proD-BTG表達的影響

IPTG對細胞有一定的毒性[16]，所以加入合適濃度的IPTG，才能使目的蛋白得到高效表達．IPTG濃度在0.01～5.0,mmol/L的范圍內可能對表達產生影響[17]．IPTG濃度對目標蛋白proD-BTG表達的影響如圖7所示．

圖7 不同IPTG濃度對proD-BTG蛋白表達的影響Fig. 7Effect of different concentration of IPTG on protein proD-BTG expression

當IPTG濃度為0.4～0.8 mmol/L時，目的蛋白的表達量隨著IPTG濃度的增加而增加，最高達到(55.62±2.34)U/L；當IPTG濃度增大到1.0 mmol/L時，目的蛋白的表達量也能達到最高，但考慮到成本的節約，將0.8 mmol/L作為IPTG的最優誘導濃度.

3 結 語

本文在前期研究的基礎上，對谷氨酸棒桿菌重組菌株C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg的發酵條件進行優化．重組菌培養12 h后A600約為2.2時，添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，誘導40 h．優化后的發酵上清液酶活力由(41.23±2.01)U/L提高到(55.62±2.34)U/L，比優化前提高了約34.90%,，為BTG進一步的高效制備奠定了基礎．

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責任編輯：郎婧

Expression of the Transglutaminase from Bacillus subtilis and Optimization of Fermentation Conditions for Corynebacterium glutamicum

HUANG Lin，LIU Yihan，LI Mingjie，LI Rui，GUO Wei，GUI Shuang，LU Fuping
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Overlap PCR was used to produce Sprodbtg encode with transglutaminase(BTG)from Bacillus subtilis．The recombined gene Sprodbtg contains signal peptide ΔS0949 from Corynebacterium glutamicum，SD sequence and the proDBTG gene．The sprodbtg was cloned into pXMJ19 to construct secretion expression vector pXMJ19-Sprodbtg．After that，the recombined plasmid was transformed into C．glutamicum ATCC13032 to express proD-BTG．The optimized fermentation conditions were also studied．The results showed that the recombined strain C．glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg accumulated proD-BTG up to a level of (41.23±2.01)U/L．The optimized conditions for the induction of expression of the recombined protein proD-BTG in strain 13032/pXMJ19-Sprodbtg were as follows：growing in MMTG medium for 12 h，adding IPTG with a final concentration of 0.8 mmol/L and the subsequent incubation for 40 h．The activity of BTG reached (55.62±2.34)U/L，a 34.90%, increase compared with the non-optimized control.

transglutaminase；Corynebacterium glutamicum；Bacillus subtilis；secretion expression；condition optimization

Q814.4

A

1672-6510(2016)06-0011-06

10.13364/j.issn.1672-6510.20160044

2016-02-18；

2016-05-16

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃資助項目(14JCYBJC23800)；天津市科技特派員資助項目(15JCTPJC56500)

黃 琳（1984—），女，天津人，實驗師；

路福平，教授，lfp@tust.edu.cn.

數字出版日期：2016?07?11；數字出版網址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20160711.1615.010.html.